根癌农杆菌介导的花生遗传转化的研究

【摘要】：实验比较了11个花生品种在MS和1／2MS培养基中萌发情况，及其在4种芽诱导培养基中的叶段芽诱导率；并观察了70％酒精和0.1％升汞不同处理时间的灭菌效果及其对种子萌发的影响。结果表明：花生种子在酒精处理20～30s和升汞处理10～12min灭菌效果理想，萌发率高；种子萌发率在1／2MS培养基中要比MS培养基高；芽诱导率以汕油523最高，在芽诱导培养基1中为93.1％，汕油31最差，在芽诱导培养基2中仅为9.5％。 采用简化的碱法少量提取法、简便快速的煮沸法及试剂盒法提取质粒pCB302-3，并通过一对特异引物对质粒DNA进行PCR扩增，分别对各种方法所提取的质粒DNA及其PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果表明碱法少量提取法和试剂盒法所提取的质粒DNA纯度和产量高，且重复性好，其中简化的碱法少量提取法具有结果稳定和经济的特点。 在本实验室对影响花生遗传转化效率的PPT筛选压、根癌农杆菌的侵染浓度、侵染时间及共培养时间等重要因素的研究基础上，采用根癌农杆菌转化花生叶片，成功地将抗虫基因豇豆蛋白酶抑制基因(CpTI)和耐除草剂基因(Bar)导入花生。实验结果表明，外植体在MS+3mg/L BA+0.8mg／L NAA+2mg/L AgNO_3+6mg/L Gln培养基上预培养3d，于OD_(60C)为0.3的农杆菌菌液中浸泡5～7min后培养2d，再转移至含有3mg/L BA+0.8mg/L NAA+2mg/LAgNO_3+6mg／L Gln+500mg/L Cb+300mg/L Cef+0.25mg/L PPT的MS培养基诱导筛选培养，3个月后得到24个再生株系，经过PCR初步检测，有7个株系显示了310bp的CpTI基因核酸片段，Southern杂交证实5个株系外源基因的整合，并且外源基因能够遗传。通过转基因花生植株后代的抗虫性分析，转基因花生表现出一定的抗棉铃虫和斜纹夜蛾活性。 另外，本实验研究了负压和超声波两种辅助处理方法对转化的影响，评价了不同强度的负压和超声波处理时间对外植体芽诱导率的影响。实验结果表明：较低强度(抽拉30次)的负压处理和短时间(2min)的超声波处理对外植体芽再生的影响较小，虽然延长了再生时间，但是有助于提高PPT(草丁磷)抗性芽的再生率，Southern杂交证实两种方法分别有6个株系和3个株系外源基因的整合。

【学位授予单位】：汕头大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：S565.2