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头孢地嗪对小鼠中性粒细胞的免疫调节作用及其机制研究

宋卉  
【摘要】:目的 观察头孢地嗪(Cefodizime,CDZ)对肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae,Kle.p)引起的小鼠肺部炎症反应过程中,中性粒细胞(Polymorphonuclear neutrophil granulocytes,PMN)分泌细胞因子的变化,并探讨其与LPS-TLR-NFкB信号传导通路的关系。 方法 1.建立肺炎模型:经热灭活后的Kle.p 1x10~7CFU悬浮于50μ1PBS中,经鼻吸入法感染小鼠肺部。 2.给药方式及剂量:感染前96h开始给药,至接种细菌:将CDZ溶于PBS中30mg/kg,次/12h,皮下注射给药。 3.PMN的分离:感染3-24h后,不连续密度梯度法分离腹腔灌洗液中的PMN。 4.PMN表达的细胞因子种类强度分析:以含有96种细胞因子基 汕头大学医学院博士研究生学位论文 因表达谱的芯片检测感染前、后小鼠PMN表达细胞因子种类及强 弱变化。 5.尹材N.麦送匆分蘑时了W界a柳IL一叨总娜在感染的不同时间, 以Rl’- PCR方法检测PMN中TNF一a和IL一lp的mRNA表达情况; 以ELisA检测TNF一a、IL一lp分泌量的变化;以westem blot分析 PMN内TNF一a、几一lp蛋白的表达。 6.呼吸塌发翻启;以硝基四氮哇蓝还原实验(NBT test)检测PMN氧 依赖的呼吸爆发释放活性氧的情况。 7.LP害.TLR.八子吮刀朦号传导通雳研穷{R:T- PCR方法检测PMN中 Toll样受体4(TLR4) mRNA表达情况;W七Stem blot分析PMN内 I一沼量的变化以反映其活性变化;凝胶电泳迁移率分析实验 (Eleetrophoretie mobility shift ass盯,EMSA)检测PMN.内核因子沼 (Nuelear factor一沼,NF一忍)的转录活性。 结果 小鼠PMN能表达多种细胞因子,热灭活Kle.p可 诱导护什吓一a及IL一lp等基因表达增加。 2.不N界。和IL一叨mR八月碑麦巡二卖COz对真彭嗬; (1)小鼠感染热灭活Kle.p后,PM囚中TNF一a和IL一1乃的mRNA表达 明显增强。TNF一Q表达在6h最强;几一IB表达在12h达到最高;24h 后二者表达均明显减弱但仍较对照组强。 汕头大学医学院博士研究生学位论文 (2)与模型组相比,CDZ促进感染3一6h后TNF一。和IL一1旦表达,但 削弱了感染12一24h的TNF一Q和24h后的IL一1日mRNA表达。 (3)CDZ 显影响 对未感染小鼠PM[N的TNF一Q和IL一1 pmRNA表达未见明 3.只UN道沙zN矛’-。柳IL一叨蛋户浦之友‘刀z刀真影时 (l)在未感染小鼠PMN胞内TNF一。和IL一IB蛋白量较少,以Westem blot手段较难检出。Kle.p感染3h后,可见PMN胞内细胞因子的蛋 白表达增加,6h后最高,12h后降低。 (2)与模型组相比,CDz增强了感染小鼠感染3h后的TNF一a和3一1 Zh 的IL一1 6PMN胞内蛋白表达,而降低感染12h后的TNF一Q和24h 后的IL一lp表达。 (3)CDZ 显影响 对未感染小鼠PMN胞内TNI;Q和IL一1日的蛋白表达未见明 4.尸材N分泌劣里N声乙a、IL一1刀才平及CDZ训对真彭碱 (l)小鼠感染热灭活Kle.p后,PMN分泌的TNF一。及IL一lp水平升高; TNF一。在感染后6h最高,24h后明显降低,但仍较对一照组高;而 IL一lp在12h最高,24h后仍有较高分泌量。 (2)与模型组相比,CDz增加了感染Kle.p小鼠3一6h后pMN的TNF- a和IL一lp分泌量、而降低感染12h后二者的分泌量。 (3)CDZ对未感染小鼠PMN的T哪一a和IL一lp分泌未见明显影响。 5一只UN时呼蟹廖发飞 汕头大学医学院博士研究生学位论文 (1)热灭活Kle.p感染促进小鼠PMN的呼吸爆发,以感染3h后最强, 此后渐低,但24h后仍较未感染组强。 (2)与模型组相比,CDZ加强了小鼠感染3h后的呼吸爆发,12h后降 低其呼吸爆发强度,24h后几乎回落至感染前水平。 (3)CDZ对未感染小鼠的呼吸爆发无明显影响。 6 .LP.多TLR.八子吮B存号撵.早涵歇 (l)感染Kle.p后PMN中I破B水平明显降低,感染3h最低,6h后回 升,但在相同时间点上仍较未感染组低。与感染组相比,CDZ处理 可进一步降低感染6h内小鼠PMN中I一kB水平,而升高12一24h后 其水平;对未感染小鼠I一忍水平未见明显影响。 (2)感染Kle.p刺激3h后TLR4的mRNA表达明显增加;6一24h后的 增加不明显。CDZ促进感染3一24h后的表达,3h后最明显。对未感 染小鼠也有促进TLR4mRNA表达的作用。 (3)在对照组小鼠PMN中,未见N’F一KB的激活,Kle.p感染后NF- KB的DNA结合活性明显加强,3h后最强,随后逐渐减弱。CDZ 明显加强感染6h内PMN的NF一KB活性,而在12h后则减弱其活 性。CDZ对未感染小鼠PMN的NF一KB的活性无明显影响。 结论 CDZ对Kle.p感染诱导的小鼠PMN有双向免疫调节作用,其 机制与调节TLR4表达和哪一沼的转录活性,从而影响TNF一a、IL一lp 汕头大学医学院博士研究生学位论文 等促炎因子的表达有关。


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