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Map30植物表达载体的构建及转化花生、烟草的研究

彭桂庄  
【摘要】:MAP30全称为:“苦瓜子抗人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白30(momordica anti-HIV protein of 30000,MAP30)”,是20世纪90年代由美国科学家Lee-Huang等从葫芦科植物苦瓜种子中提取的一种植物核糖体失活蛋白,具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的活性,并可以提高植物抗病的能力,在临床医学和农业方面有着光明的应用前景。map30植物表达载体的构建和农杆菌介导的转基因研究国内外少有报导,本实验构建了map30基因植物表达载体,转化了花生和烟草,以期使转基因的花生、烟草获得抗菌,抗病毒的特性,从而为植物抗性育种提供亲本资源。 1.map30植物表达载体的构建和验证:本实验将map30基因亚克隆到二元载体pCAMBIA2303上,获得pCAMBIA2303-map30载体。进一步将此载体转化农杆菌GV3101,EHA105,经酶切验证构建成功。将农杆菌GV3101/pCAMBIA2303-map30转化烟草愈伤组织,GUS瞬时表达通过GUS组织化学染色得到证实。转化的愈伤组织诱导的芽经PCR检测初步证实了map30基因已经导入烟草。 2.花生直接转化体系的建立和优化。将去掉一片子叶的花生种子在萌发培养基上预培养后,用针刺子叶节点放回到原培养基共培养,共培养后进行抑菌培养。通过GUS组织化学染色阳性率确定最佳的农杆菌侵染浓度OD_(600)为0.3~0.6,侵染前最佳预培养时间是2d,侵染后最佳共培养时间为1d~2d。在农杆菌GV3101/pCAMBIA2303-map30转化实验的14个花生品种(系)中,实验得出对该转化体系以及农杆菌非常敏感的花生品种(系)有6个,阳性率在40%以上;敏感的有5个,阳性率在20%~26.67%之间;不敏感的有3个,均没有检测到阳性。用菌株EHA105/pCAMBIA2303-map30的转化实验中GUS组织化学染色均未检测到阳性植株。 3.直接转化体系转化目的基因的研究。GV3101/pCAMBIA2303-map30基因转化14个品种(系)花生当中,PCR筛选有汕油212和H716等4个品种(系)有16个阳性株系。抗盐基因mt1d转化仲恺花1号,汕油217等品种,PCR筛选有2个阳性株系。 4.叶盘法将map30转化汕油162和汕油217等花生品种,PCR筛选转化苗,


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