三氧化二砷抑制鼻咽癌细胞EB病毒潜伏膜蛋白1及其抗癌效应的研究

【摘要】：研究背景和目的：鼻咽癌与EB病毒感染关系密切，EB病毒编码的潜伏膜蛋白(LMP1)在鼻咽癌的形成和发展起着重要作用：阻断分化、抑制凋亡、促进转移。在我们的前期工作中表明传统中药三氧化二砷(As_2O_3)能够诱导鼻咽癌移植瘤分化与凋亡。但是该药的作用机制是否涉及抑制LMP1目前仍不清楚，值得我们作进一步的研究。为此，本论文分二部分对上述问题进行研究：首先是研究As_2O_3是否抑制LMP1的表达及其在鼻咽癌细胞凋亡中所起的作用；然后是探讨经As_2O_3处理后残留细胞潜在转移能力及与LMP1的关系。旨在为开拓As_2O_3在鼻咽癌应用提供参考。 方法：以稳定表达LMP1的低分化鼻咽癌细胞株HNE1-LMP1与不表达LMP1的亲本细胞株HNE1为体外研究对象。第一部分：HNE1-LMP1细胞与含有不同浓度的As_2O_3培养基(0、1、2、3、4、5 μmol／L)共同培养48小时，采用免疫印迹法及激光共聚焦分析LMP1蛋白表达的变化：应用RT-PCR方法，分析LMP1 mRNA的含量。然后，两株细胞接受不同浓度的砷处理48小时，MTT法检测其半数抑制浓度，了解其对砷的不同敏感性；选择2、4 μmol／L As_2O_3为研究点，采用相差倒置显微镜、HE染色法及TUNEL法检测细胞的形态变化及凋亡情况；采用Southernblotting检测端粒长度的变化，探讨LMP1下调在细胞凋亡中所起的作用。第二部分：收集3 μmol／L方法处理后仍贴壁的细胞，分析其潜在的转移能力。首先是通过其克隆形成率了解其潜在增殖能力；然后应用人工基底膜的方法评价两株残留细胞的粘附、侵袭、穿透能力的变化；Western blot、免疫组化和RT-PCR法分析MMP-9的蛋白水平及mRNA含量变化。 结果：第一部分：一定剂量下的砷(2μmol／L以上)作用48h影响LMP1表达，LMP1受抑制程度与砷的浓度相关，浓度越高，抑制越明显；LMP1阳性的细胞对砷的反应性较好，As_2O_3作用下48小时，HNE1-LMP1的半数抑制浓度是2.22μmol／L，HNE1细胞的半数抑制浓度是5.09Pcnol／L，2、4 μmol／L的凋亡指数分别是23.44±2.4％和40.63±5.7％，相比之下，HNE1细胞的凋亡指数分别是13.66±1.49％和29.85±3.05％1 HNE1-LMP1细胞端粒长度缩短也明显，与LMP1的下调相平行，而在HNE1细胞，端粒仅有轻微的缩短。第二部分：As_2O_3 μmol／L