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《汕头大学》 2007年
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共振光散射技术测定氨基酸及生物大分子新方法的研究与应用

刘锦斌  
【摘要】: 共振光散射(Resonance Light Scattering,RLS)技术是分子光谱领域中的一种新兴的分析方法。RLS技术因其灵敏度高、选择性好、仪器简单等特点己经引起了国际国内生化分析界的浓厚兴趣和广泛关注。近十几年来,特别是具有可识别功能的新型RLS探针的开发与应用,更加推动了具有高灵敏检测特点的RLS光谱分析的快速发展,在生化分析中发挥了重要的作用,并显示出巨大的应用潜能。进一步研究和发展高灵敏度、高选择性和简便快捷的RLS测定新方法和新体系,自然成为分析工作者备受重视的研究课题。 本学位论文的主要内容是采用新兴的RLS技术建立了测定氨基酸以及生物大分子(包括蛋白质与核酸)的8种RLS新方法,并综合利用多种光谱手段、电镜以及原子力显微镜等手段探讨了其作用机理。其主要内容如下: 金属铁卟啉(FeTPPC1)、金属锰卟啉(MnTPPC1)、金属钴卟啉(CoTPPC1)以及μ-氧代双(四苯基卟吩合铁)[(FeTPP)_2O]测定组氨酸。首次研究了以FeTPPC1、MnTPPC1及CoTPPC1等单核金属卟啉为RLS探针测定组氨酸体系的光谱特征,分别考察了其影响因素以及适宜的反应条件。在弱碱性的B-R缓冲溶液中,FeTPPC1、MnTPPC1及CoTPPC1与组氨酸结合后,均能产生强烈的RLS增强,且体系所产生的RLS强度的增强与加入的组氨酸的浓度在一定的范围内呈线性关系。从而建立了3种选择性好、灵敏度高的测定组氨酸的RLS新方法。各种单核金属卟啉测定组氨酸的灵敏度不同,本文分别讨论了其测定结果的差异。FeTPPC1、MnTPPC1及CoTPPC1测定组氨酸的线性范围分别为:1.8×10~(-6)-2.7×10~(-5)mol/L、7.8×10~(-7)-2.4×10~(-5)mol/L及5.1×10~(-7)-1.4×10~(-5)mol/L,其检出限分别为:1.4×10~(-7)mol/L、9.2×10~(-8)mol/L及4.3×10~(-8)mol/L。在前面研究过3种单核金属卟啉测定组氨酸的基础上,又进一步考察了组氨酸与双核金属卟啉(FeTPP)_2O的相互作用,并探讨双核金属卟啉与单核金属卟啉在作用机理上的差异,建立了一种更加灵敏的测定组氨酸的RLS新方法。(FeTPP)_2O与组氨酸相互作用产生更加强烈的RLS增强,其测定的线性范围为:4.0×10~(-7)-1.9×10~(-5)mol/L,检出限为:3.6×10~(-8)mol/L。该测定方法比单核金属卟啉测定组氨酸更加灵敏。 氨基酸型表面活性剂月桂酰谷氨酸钠(SLG)、月桂酰肌氨酸钠(SLS)以及海藻多糖海藻酸钠(SA)RLS法测定蛋白质。在优化条件下,SLG与蛋白质结合后产生强烈的RLS增强信号,RLS的增强与蛋白质浓度在一定范围内呈线性关系。牛血清白蛋白、人血清白蛋白、γ-球蛋白、溶菌酶和牛血红蛋白的线性范围分别为:0.01-2.7μg/mL,0.04-2.2μg/mL,0.08-1.7μg/mL,0.08-3.1μg/mL和0.01-1.3μg/mL,检出限分别为:1.4ng/mL,1.7ng/mL,2.8ng/mL,4.6ng/mL和5.8ng/mL。实验结果表明,静电作用是SLG与蛋白质相互作用的最主要的作用力之一。而对于SLS与蛋白质的相互作用,在最优化条件下,在SLS与蛋白质的相互作用中疏水作用和静电作用共同起着重要的作用。牛血清白蛋白、人血清白蛋白、γ-球蛋白、溶菌酶、牛血红蛋白和鸡蛋白的线性范围分别为:0.0025-1.2μg/mL,0.0075-0.9μg/mL,0.02-1.4μg/mL,0.04-2.1μg/mL,0.01-0.6μg/mL和0.02-0.8μg/mL,检出限分别为:1.3ng/mL,0.8ng/mL,2.7ng/mL,3.2ng/mL,4.3ng/mL和3.9ng/mL。另外,我们还研究了海藻酸钠(SA)与蛋白质在B-R缓冲溶液中的RLS光谱性质。以海藻多糖为RLS探针测定蛋白质未见报道。SA与蛋白质作用后体系产生强烈的RLS增强,所增强的RLS强度与蛋白质浓度呈良好线性关系。牛血清白蛋白与人血清白蛋白的线性范围分别为:0.05-9.5μg/mL和0.01-6.0μg/mL,检出限分别为:1.8ng/mL和1.5ng/mL。以上共建立了3种测定生物体系中微量蛋白质的RLS新方法。 Gemini型两性离子表面活性剂磷酸二酯季铵盐(PQAS)RLS法测定核酸。PQAS是一类Gemini型两性离子表面活性剂,与单体表面活性剂相比,Gemini表面活性剂具有丰富多样的分子有序聚集体形状和特性,具有了传统表面活性剂所不具备的性质。以Gemini型两性离子表面活性剂为RLS探针测定核酸未见报道。PQAS与核酸相互作用后,体系的RLS强度急剧增强,且所增强的RLS强度在一定的范围内与核酸的浓度成正比,据此建立了一种灵敏的测定核酸的RLS新方法。小牛胸腺DNA与鱼精DNA的线性范围分别为:0.01-9.0μg/mL和0.04-7.5μg/mL,检出限分别为:1.4ng/mL和2.5ng/mL。
【学位授予单位】:汕头大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:O657.3

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