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硫矿硫化叶菌小热激蛋白SsHSP14.1的功能特性研究

闻真珍  
【摘要】:小热激蛋白(small heat shock proteins, sHSP)广泛分布于自然界生物体内。大量研究证明,小热激蛋白具有提高细胞耐热性,并能抑制蛋白变性、促进蛋白重折叠的功能。嗜热微生物来源的小热激蛋白更是由于其具有耐高热的特性而备受关注。但是由于小热激蛋白具有多态性,对其结构研究还不够充分,其作用机制更是不甚了解。因此,对小热激蛋白的深入研究,不仅具有重要的科学价值,同时也能为其应用奠定坚实基础。 本论文首次对硫矿硫化叶菌来源的小热激蛋白SsHSP14.1进行克隆、表达与纯化,并对其功能与机制进行了研究。具体内容如下: SsHSP14.1蛋白的克隆、表达与纯化:以硫矿硫化叶菌的基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到了SsHSP14.1的编码基因,与表达载体pET28a连接后成功构建了SsHSP14.1的表达质粒。将该表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,筛选获得高SsHSP14.1蛋白表达的菌株。大肠杆菌蛋白表达优化条件为:接种量5%, IPTG浓度1mM,最佳诱导温度为25℃,诱导时间6h。优化的蛋白纯化过程为:细胞破碎-镍柱亲和层析(300mM咪唑洗脱目标蛋白)-3C蛋白酶酶切-Q柱去除3C蛋白酶(pH8.0收穿透)-Q柱分离目标蛋白(pH9.0, 0.2MNaCl洗脱目标蛋白),最终得到的蛋白纯度为92%,比菌体粗提液中蛋白纯度提高了两倍,纯化后蛋白得率为27.62%。 SsHSP14.1的蛋白功能特性研究:1)研究确定了SsHSP14.1能够提高大肠杆菌耐热性。研究了表达和不表达SsHSP14.1蛋白的大肠杆菌,比较了两者在高温下的存活率,大肠杆菌经50℃热激处理1h后,表达SsHSP14.1的大肠杆菌存活率为31.2%,显著高于不表达SsHSP14.1的大肠杆菌存活率(19.9%);2)研究确定了SsHSP14.1具有抗热凝集特性。大肠杆菌在80℃条件下处理2h后,加入SsHSP14.1可使46.8%的大肠杆菌蛋白保持在可溶性状态,而不加入SsHSP14.1的对照组,90%的大肠杆菌蛋白都已聚集沉淀;当以CALB为底物时,酶液在50℃条件下处理20min后,SsHSP14.1的加入可使可溶性蛋白的含量提高到原来的2倍。3)研究了SsHSP14.1对提高酶热稳定性的影响。菠萝蛋白酶在60℃条件下温育40min后均失活,而加入SsHSP14.1后,能保留40%的酶活,加热1h后仍有30%的酶活。EcoRI在60℃下温育20min后完全失活,加入SsHSP14.1后,温育40min后酶才完全失活。4)研究了ATP依赖性、聚合特性、热稳定性等特性。结果证明SsHSP14.1提高EcoRI热稳定性的功能不需要ATP的参与; SsHSP14.1以大的多聚体(360kD)形式存在,多聚体的大小与盐浓度等有关;SsHSP14.1具有极强的热稳定性,在100℃中加热15min后,仍保持其分子伴侣活性。 SsHSP14.1作用机制的研究:通过同源建模,得到SsHSP14.1的二聚体结构模型,在该模型的基础上,对蛋白的关键氨基酸位点(L109、E33、K75、K75-Q79)进行突变,克隆、表达与纯化相应蛋白突变体,对突变体蛋白(L109D、K75E、E33K/K75E、DEL75-79)的结构和功能进行了分析,并与原始蛋白功能特性进行比较。结果表明,1)L109、K75、E33是决定蛋白结构与功能的关键位点。突变蛋白L109D和K75E都以单体存在,并且不具有分子伴侣活性。而K75E/E33K与SsHSP14.1都形成大的聚合物,并具有相似的功能;2) L5-7结构域对于小热激蛋白提高酶耐热性的功能具有重要作用。L5-7结构域缺失后,突变蛋白DEL75-79的聚合状态变化甚微,仍具有与SsHSP14.1相似的抗凝集特性,但失去了提高EcoRI和菠萝蛋白酶热稳定性的保护功能。ANS荧光探针检测实验证明,DEL75-79的表面疏水性降低,减弱了其与底物结合的能力,这进一步说明其功能的改变与结构相关。


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