收藏本站
《华南理工大学》 2010年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

何首乌芪合酶基因(FmSTS)的克隆、鉴定及转化拟南芥研究

生书晶  
【摘要】:何首乌[Fallopia multiflora(Thunb.)]属于蓼科多年生缠绕草本植物,其块根(何首乌)和藤茎(夜交藤)都可作药用。何首乌提取物中含有许多对人类健康有益的活性成分,其中最重要的是二苯乙烯苷等芪类化合物。研究证实,二苯乙烯苷在降血脂、抗衰老、保护心血管及抗动脉粥样硬化方面都有很好的应用前景。然而,有关何首乌中芪类化合物生物合成途径的研究还未见报道。 已有研究表明白藜芦醇等三羟基芪类物质是经苯丙氨酸途径由芪合酶(stilbene synthase,STS)催化合成,而何首乌中二苯乙烯苷等四羟基芪是否同样由STS催化合成还未见文献报道。为了深入研究何首乌中芪类化合物的生物合成途径,并为今后利用基因工程技术提高二苯乙烯苷类的含量奠定基础,本课题针对何首乌中的STS基因展开研究。首先运用同源扩增和RACE技术获得何首乌中STS基因的全长cDNA序列,并通过原核表达后酶催化反应对该基因表达的重组蛋白进行了功能鉴定;随后,将该基因转化拟南芥,检测到转基因植株中有芪类物质——白藜芦醇苷产生,证实FmSTS基因在植物体内能够催化芪类物质的合成。这将有助于深入研究FmSTS基因在何首乌芪类次生代谢产物生物合成途径中的功能。本文的主要研究结果如下: (1)为了避免何首乌RNA提取过程中多糖、多酚类物质的污染,对常规CTAB法进行了部分改良。结果,改良CTAB法提取的何首乌各组织RNA产量较高,纯度和完整性都较好,可以用于后续的RT-PCR、RACE扩增以及Northern blot分析。 (2)根据STS的保守区氨基酸序列设计引物,首次采用RACE技术从何首乌中分离到STS全长cDNA序列,将其命名为FmSTS,Genebank登录号为GQ411431。序列分析发现,FmSTS基因编码的蛋白序列含有379个氨基酸,分子量为41.25 kDa,等电点为5.90。该蛋白序列与蓼科植物虎杖、大黄的STS序列同源性都较高,且含有STS家族绝对保守的Cys-His-Asn催化活性中心结构。 (3)克隆了FmSTS的全长基因序列,Genebank登录号为GQ411432。与其cDNA序列比较后发现,FmSTS基因含有三个内含子,这一结构在STS家族中非常少见,因为STS家族基因结构相当保守,大多数基因都只在Cys60的位置含有一个内含子。Southern blot分析表明,FmSTS基因在何首乌基因组中至少含有3个不同的等位基因,是一个多基因家族。 (4)为了对FmSTS基因进行鉴定,将其插入原核表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达。SDS-PAGE电泳结果显示,重组FmSTS蛋白分子量约为42 kDa,主要以包涵体的形式存在。通过优化表达条件,得到了可溶性的重组蛋白。经Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和纯化后,重组FmSTS蛋白具有天然芪合酶的活性,能够催化丙二酰-CoA和香豆酰-CoA反应合成白藜芦醇。另外,利用葡萄STS抗体,对重组FmSTS蛋白进行了Western blot分析。结果抗体能够与重组蛋白特异结合,而只转化pET-28a(+)空载体的对照菌体蛋白没有杂交信号,从而在免疫学角度也证实了我们克隆的FmSTS基因确实是STS基因。 (5)为了进一步研究FmSTS基因在植物体内的代谢功能,构建了含有CaMV 35S组成型启动子的植物表达载体pCAM-FmSTS,并通过农杆菌介导的花序浸泡法转化拟南芥。经过潮霉素抗性筛选、基因组PCR以及RT-PCR,证实FmSTS基因已经整合入拟南芥的基因组中,并能够正常的转录和表达。经高效液相色谱分析和质谱鉴定,多数转基因植株中均能够产生芪类物质——白藜芦醇苷,最高含量达65.3μg /g拟南芥鲜重。 (6) FmSTS基因在何首乌中的转录具有组织特异性,在块根和老藤中表达量较高,在幼嫩的茎叶中表达量较低,而在老叶中几乎没有表达。这种转录模式与HPLC测得的二苯乙烯苷在何首乌各组织中的分布模式一致,表明FmSTS基因可能在二苯乙烯苷的生物合成途径中起一定的作用。
【学位授予单位】:

知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 徐承水;何首乌提取物对大鼠过氧化损伤的保护作用[J];烟台师范学院学报(自然科学版);2000年03期
2 徐承水,王文房;何首乌提取物对大鼠血脂水平的影响[J];曲阜师范大学学报(自然科学版);2004年03期
3 李丽春,吴晓东,田维熙;何首乌提取物对脂肪酸合酶的抑制作用[J];中国生物化学与分子生物学报;2003年03期
4 王英锋,许彬,余启荣,曹淑萍;正交试验优选血脂胶囊提取工艺[J];首都师范大学学报(自然科学版);2003年03期
5 佟泽勇;宋媛媛;;高速逆流色谱法一步分离何首乌中的二苯乙烯苷[J];黑龙江科技信息;2011年25期
6 张伦;谭凯丽;廖海民;胡正海;;何首乌生长过程中二苯乙烯苷的含量变化[J];西北植物学报;2010年07期
7 李银科;蔡正洪;韦晓华;何秀琼;;微波技术在何首乌药材加工中的应用研究[J];西南民族大学学报(自然科学版);2009年01期
8 万近福;杨昌红;董明;韦建荣;;珍珠菜的化学成分研究(英文)[J];天然产物研究与开发;2011年01期
9 龙石银;张彩平;乔新惠;黄良珠;田英;高细强;佟丽;;二苯乙烯苷对氧化诱导内皮细胞凋亡及Caspase-3和PARP表达的影响[J];生物化学与生物物理进展;2011年11期
10 张丽;赵宁;王蓉;李林;;参乌胶囊及其有效成分二苯乙烯苷对老年大鼠脊髓腰节段细胞凋亡调节因子及p-CREB的影响[J];中国比较医学杂志;2010年08期
11 杜晨晖;王兴红;赵荣华;赵声兰;;发酵法炮制何首乌的初步研究[J];天然产物研究与开发;2008年03期
12 黄华;;不同炮制工艺对何首乌中成分含量的影响[J];黑龙江科技信息;2011年19期
13 孙晋苓;黄晓兰;吴惠勤;黄芳;;液相色谱/离子阱质谱法研究何首乌中糖苷类化合物[J];天然产物研究与开发;2009年05期
14 马文祥,傅佑丽;何首乌醇提取物对兔皮肤稳态的实验研究[J];曲阜师范大学学报(自然科学版);2001年03期
15 张翠,冯磊,李秀兰,徐承水;不同细胞密度和脉冲电压对鸡红血细胞融合率的影响[J];曲阜师范大学学报(自然科学版);2005年02期
16 江正祥;;蓼科植物抗金黄色葡萄球菌的研究现状[J];科技资讯;2010年30期
17 ;[J];;年期
18 ;[J];;年期
19 ;[J];;年期
20 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 李沛沛;段西凌;李福民;;何首乌二苯乙烯苷对小鼠皮肤光老化保护作用机制的研究[A];2009全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2009年
2 孙芳玲;李林;;何首乌二苯乙烯苷对神经突触的影响及作用机制研究[A];全国第十二届生化与分子药理学学术会议论文集[C];2011年
3 李雅莉;张兰;李林;;二苯乙烯苷对过度表达α-synuclein蛋白的转基因细胞的影响[A];2011全国老年痴呆与衰老相关疾病学术会议第三届山东省神经内科医师(学术)论坛论文汇编[C];2011年
4 李雅莉;张兰;李林;;二苯乙烯苷对转α—synuclein蛋白基因细胞的影响[A];全国第十二届生化与分子药理学学术会议论文集[C];2011年
5 许冬瑾;陶艳;陈华师;程文胜;尤北宏;;HPLC法测定四种何首乌高压炮制品中二苯乙烯苷的含量[A];2010中药炮制技术、学术交流暨产业发展高峰论坛论文集[C];2010年
6 常慕君;王勇;肖军花;王嘉陵;;二苯乙烯苷对糖尿病胃肠功能紊乱的保护作用[A];中国药理学会第十一次全国学术会议专刊[C];2011年
7 杨克义;陈华师;;不同产地制何首乌中二苯乙烯苷的测定[A];中华中医药学会中药炮制分会2011年学术年会论文集[C];2011年
8 李福双;杨桠楠;申毅;冯子明;姜建双;张培成;;虎杖中一类具有抗糖尿病活性的二苯乙烯苷类化学成分研究[A];2011年中国药学大会暨第11届中国药师周论文集[C];2011年
9 魏学冰;王兰霞;杨锡;冯祥瑞;;高效液相色谱法测定参芪博力康片中淫羊藿苷及二苯乙烯苷的含量[A];西北地区第六届色谱学术报告会甘肃省第十一届色谱年会论文集[C];2010年
10 刘振丽;宋志前;;炮制对何首乌中二苯乙烯苷含量的影响[A];中华中医药学会第三届中药炮制分会学术会议论文集[C];2003年
中国重要报纸全文数据库 前3条
1 常怡勇;何首乌对神经细胞有保护作用[N];中国医药报;2004年
2 ;六大学会联手探索生命科学[N];中国医药报;2003年
3 张国民;现代化进程中的中药质量标准[N];中国医药报;2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 生书晶;何首乌芪合酶基因(FmSTS)的克隆、鉴定及转化拟南芥研究[D];华南理工大学;2010年
2 邵利;何首乌悬浮细胞系的建立和稳定同位素示踪研究二苯乙烯苷合成路径[D];华南理工大学;2012年
3 路艳;补肾法对骨髓抑制模型骨髓干细胞的调控机理研究[D];广州中医药大学;2012年
4 曾诚;二苯乙烯苷对炎症性肠病的作用:诱导PPAR-γ和抑制NF-κB及其炎症通路[D];华中科技大学;2011年
5 王春英;何首乌有效成分二苯乙烯苷的降血脂作用与药物代谢动力学研究[D];河北医科大学;2008年
6 廖海民;何首乌和木立芦荟的结构发育与有效成分积累相关性的研究[D];西北大学;2006年
7 胡友财;基于活性筛选和化学筛选的短萼仪花茎皮活性成分的研究[D];中国协和医科大学;2008年
8 曾诚;二苯乙烯苷对炎症性肠病的作用:诱导PPAR-γ和抑制NF-κB炎症通路[D];华中科技大学;2011年
9 常慕君;二苯乙烯苷对糖尿病胃肠动力紊乱的保护作用及其机制[D];华中科技大学;2012年
10 周琳;二苯乙烯苷对阿尔茨海默病大鼠突触可塑性损伤的保护机制研究[D];中南大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 吴琼;何首乌水提物对小鼠黑素瘤细胞黑色素生成影响的研究[D];华中科技大学;2009年
2 吴琼;何首乌水提物对小鼠黑素瘤细胞黑色素生成影响的研究[D];华中科技大学;2009年
3 李娅琳;何首乌中鞣质及其与二苯乙烯苷不同配比对大鼠肝脏的影响[D];陕西中医学院;2010年
4 李文;广西生何首乌天然小分子化合物的提取分离及抗肿瘤活性筛选[D];广西医科大学;2010年
5 廖勇;何首乌二苯乙烯苷抑制长波紫外线诱导的HaCaT细胞氧化应激损伤[D];第二军医大学;2010年
6 李晓冰;二苯乙烯苷通过调节ROS相关的JNK及线粒体通路减轻MPP+诱导的PC12细胞凋亡[D];第四军医大学;2010年
7 崔慧辉;二苯乙烯苷对氧化损伤人脐静脉内皮细胞NF-κB/IκB表达的影响[D];南华大学;2010年
8 韦晓华;何首乌中二苯乙烯苷的分离纯化及缓释微囊的制备[D];西南交通大学;2010年
9 田汝芳;二苯乙烯苷对H_2O_2诱导血管内皮细胞粘附分子表达的影响[D];南华大学;2010年
10 张旭;硫脲类催化剂催化不对称Aza-Henry反应研究和四羟基二苯乙烯苷提取纯化工艺研究[D];第四军医大学;2012年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978