收藏本站
《华南理工大学》 2010年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

豆豉纤溶酶定向进化及突变酶基因的表达研究

张少平  
【摘要】:豆豉纤溶酶(Douchi fibrinolytic enzyme,DFE)是从中国传统发酵食品豆豉中发现的新型纤溶酶,具有开发成新一代溶栓药物和相关功能食品的巨大潜力。本文从产纤溶酶的枯草芽孢杆菌DC12中克隆豆豉纤溶酶基因并对其进行了验证,在此基础上通过定向进化得到催化效率提高的突变酶,将突变酶基因在枯草芽孢杆菌蛋白酶缺陷株WB800中进行了诱导型分泌表达及发酵优化。主要内容与结果如下: 利用PCR技术从产纤溶酶的枯草芽孢杆菌DC-12中扩增豆豉纤溶酶基因,为验证豆豉纤溶酶基因正确与否以及方便在后续研究中对随机突变文库的筛选,将豆豉纤溶酶基因连接到表达载体pET-32a中,构建豆豉纤溶酶重组表达质粒然后转化到E.coli BL21(DE3)中,重组菌株于37℃培养至OD600为0.6左右,加入终浓度为0.4 mmol/L的IPTG于24℃进行诱导,SDS-PAGE显示表达产物同时存在于菌体破碎后的上清液和沉淀中,菌体破碎后上清液的纤溶酶活力为200 IU/mL。通过Ni-NTA亲和柱层析和Sephadex G-75分子筛层析对重组豆豉纤溶酶进行纯化,得到分子量约为28 kDa的目的蛋白,重组蛋白纯化后N-端氨基酸序列测定结果与表达质粒构建时的DNA序列推导的氨基酸序列一致。通过表达产物的纤溶酶活性、纯化后目的蛋白的分子量、纯化后目的蛋白N末端氨基酸序列测定证实所克隆的基因为豆豉纤溶酶基因。 通过易错PCR技术对豆豉纤溶酶基因进行体外随机突变,并构建突变体文库,利用血纤溶酶最适底物H-D-Val-Leu-Lys-pNA对突变体文库进行筛选,经过三轮易错PCR,筛选到对H-D-Val-Leu-Lys-pNA底物特异性提高,催化效率为未突变豆豉纤溶酶2.57倍的突变酶mDFE3。序列分析表明突变酶基因发生六处碱基突变(C119G /T236C /A308T/G397A/A633T/T705C),其中四处突变发生氨基酸取代(P40R/ V79A/ Q103L/ A133T),另两处为同义突变。 为了提高突变酶的产量并缩短发酵周期,利用PCR方法从质粒pBE3中扩增卡那霉素抗性基因并将其插入到载体pHT43中,构建了携带卡那霉素抗性基因的重组载体pHK11。PCR扩增突变酶基因并插入到pHK11中,构建了突变酶基因表达质粒并将其转入枯草芽孢杆菌蛋白酶缺陷株WB800中进行表达。将重组菌株培养至对数中期,加入终浓度为1 mmol/L IPTG进行诱导,经诱导5 h,发酵上清液纤溶酶活力达1164 IU/mL。发酵液经SDS-PAGE分析可见约28 kDa目标蛋白条带。质粒稳定性试验表明突变酶重组表达质粒在无卡那霉素的LB培养基中具有一定的分裂不稳定性,而在30μg/mL卡那霉素的选择压力下重组质粒具有良好的结构稳定性,传代50代仍具有良好的产酶能力。 对突变酶基因重组菌株进行了摇瓶条件下的产酶发酵优化研究,优化后发酵培养基:碳源为葡萄糖,浓度为2 %;氮源为大豆蛋白胨,浓度为2 %;无机盐组合为:0.6 % K_2HPO_4、0.2 % KH2PO4、0.04 % CaCl2、0.075 % MgSO_4;培养基初始pH为7.0。优化后诱导产酶条件为:250 mL三角瓶中装液量40 mL;以2 %接种量接入种子培养液;在37℃振荡培养至对数生长中期,加入终浓度为1 mmol/L的IPTG后转至30℃进行诱导。在此条件下,重组菌pHK-mDFE3/WB800发酵上清液纤溶酶活性为1948 IU/mL。
【学位授予单位】:华南理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:TQ925

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 汪光远;周艳芬;何叶喧;袁洪水;朱宝成;;中药蒲黄纤溶蛋白的分离纯化及部分性质[J];河北农业大学学报;2007年04期
2 陈连锋;田明;郭洪文;冮洁;;溶栓剂的研究进展[J];中国生物制品学杂志;2006年04期
3 张箴波,张学荣,舒雨雁;蛇毒纤溶酶的性质及应用研究[J];蛇志;2005年03期
4 李金荣;蛇毒酶治疗心脑血管病的概述[J];蛇志;2005年02期
5 刘晨光,王鹏,刘成圣,贺君,刘万顺;海洋假单胞菌纤溶酶的体外溶栓实验研究[J];中国生化药物杂志;2002年01期
6 李江伟,冉国侠,陈新梅;豆豉溶栓酶的分离纯化及其体外溶栓作用[J];中国生化药物杂志;1999年03期
7 彭勇,张义正;解淀粉芽孢杆菌DC-4豆豉溶栓酶成熟肽编码序列的克隆及表达[J];应用与环境生物学报;2002年03期
8 张仁怀,王海燕,谈宁馨,张风豪,张义正;豆豉溶栓酶基因在毕赤酵母中的表达及其产物的纯化[J];应用与环境生物学报;2005年05期
9 许芳,冯建成,李洁,石衍君,阎达中,杨艳燕;纳豆激酶基因在大肠杆菌中活性表达的比较研究[J];微生物学杂志;2004年02期
10 谢秋玲,郭勇,林剑;纳豆激酶活性测定方法[J];广东药学;2000年06期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王高学;黄海洪;梁朝军;袁明;;一株溶纤维蛋白细菌的筛选·鉴定及体外溶栓研究[J];安徽农业科学;2007年04期
2 王正刚,丁贵平,蔡正森;纳豆激酶的发酵工艺研究[J];氨基酸和生物资源;2001年02期
3 梁剑光,熊晓辉,熊强;微生物代谢产物在溶栓药物制备中的应用研究进展[J];氨基酸和生物资源;2003年02期
4 陶琳,孟凡涛,吴思方;豆豉溶栓酶的研究进展[J];氨基酸和生物资源;2005年01期
5 江晓,董明盛,江汉湖,陈伯祥;产溶栓酶纳豆菌的筛选及特性的研究[J];安徽农业技术师范学院学报;2000年02期
6 王峰;李术娜;朱宝成;武翠红;袁洪水;;W-15菌株产生的纤溶酶蛋白的提取与纯化[J];河北农业大学学报;2007年01期
7 徐速,梁金钟;益康纳豆的研制[J];大豆通报;2004年03期
8 郎亚军,隋海澜,于育玲,张苓花;纳豆枯草杆菌的分离鉴定及发酵条件优化[J];大连轻工业学院学报;2005年01期
9 崔堂兵;韩双艳;舒薇;郭勇;;豆豉纤溶酶的酶动力性质研究[J];广东工业大学学报;2006年03期
10 彭勇,张义正;豆豉溶栓酶产生菌的筛选及其酶学性质的初步研究[J];高技术通讯;2002年02期
中国重要会议论文全文数据库 前9条
1 孙婕;刘宁;;纳豆的保健功效与人类健康[A];食物功效成分与健康——达能营养中心第九次学术年会会议论文集[C];2006年
2 丁有学;刘兰;;纳豆激酶研究进展[A];2007年全国生化与生物技术药物学术年会论文集[C];2007年
3 杨艳燕;李顺意;高尚;闫达中;陈勇;;豆豉纤溶活性物—纳豆激酶的分离分析[A];中医药现代化研究学术大会论文集[C];2001年
4 高大海;梅乐和;林东强;姚善泾;;纳豆激酶的分离纯化及酶学性质的研究[A];首届长三角科技论坛——长三角生物医药发展论坛论文集[C];2004年
5 梅乐和;胡升;许静;姚善泾;郑晓冬;;纳豆枯草杆菌的筛选和纳豆激酶发酵条件优化[A];首届长三角科技论坛——长三角生物医药发展论坛论文集[C];2004年
6 Tatsumi Eizo;Yamaki Koji;;Acetylcholinesterase Inhibitory Activities of Douchi, a Traditional Chinese Food[A];都市农业工程科技创新与发展——2005北京都市农业工程科技创新与发展国际学术研讨会论文集(Ⅰ)[C];2005年
7 ;益生菌研究进展及在食品工业中的应用[A];第十一届中国国际食品添加剂和配料展览会学术论文集[C];2007年
8 Jun-Guo Liu 1,2 , Jian-Min Xing 1, Rui Shen 1, Cheng-Li Yang 1, Hui-Zhou Liu 1, * 1 Laboratory of Separation Science and Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100080, China 2 Department of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang, Hebei Province, 050018, China;PURIFICATION AND CONCENTRATION OF NATTOKINASE BY REVERSE MICELLES EXTRACTION FROM FERMENTATION BROTH[A];Proceedings of International Solvent Extraction Conference 2005[C];2005年
9 庞庆芳;张炳文;孙爱东;;中国传统豆豉溶栓活性的初步研究[A];食品安全监督与法制建设国际研讨会暨第二届中国食品研究生论坛论文集(下)[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 彭勇;豆豉溶栓酶的纯化及其基因的克隆与表达研究[D];四川大学;2002年
2 雷引林;球形纤维素/钛白粉复合扩张床吸附剂的制备及其在蛋白质纯化中的应用[D];浙江大学;2003年
3 张立央;SA/CS-CaCl_2/PMCG微胶囊及其固定化微生物细胞的培养[D];浙江大学;2003年
4 刘晓兰;根霉纤溶酶发酵、纯化和酶学性质研究[D];天津科技大学;2004年
5 高柱虎;两种新型多功能纤溶酶的鉴定及其分子生物学特性研究[D];武汉大学;2004年
6 陆瑾;温度诱导双水相金属螯合亲和分配技术的研究[D];浙江大学;2004年
7 冮洁;基因工程菌株里氏木霉合成t-PA发酵条件及r-PA基因在甲醇毕赤酵母中表达的研究[D];天津科技大学;2005年
8 刘东;根霉纤溶酶发酵过程优化及其溶栓作用的试验研究[D];天津科技大学;2005年
9 陈红歌;野油菜黄单胞菌α-淀粉酶性质及其体外定向进化研究[D];南京农业大学;2005年
10 肖璐;溶栓酶基因的克隆及表达[D];四川大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 杜木英;毛霉型豆豉生物速成发酵技术的研究[D];西南农业大学;2001年
2 梁思宇;枯草杆菌溶纤酶高产菌株的选育及发酵条件的优化[D];南京农业大学;2000年
3 刘诚;纳豆激酶液体发酵条件及其酶学稳定性研究[D];南京农业大学;2000年
4 田艳;纳豆菌液体发酵产生纤溶酶的研究[D];华南热带农业大学;2001年
5 张勇;离子诱变选育纤溶酶(Plasmin)高产菌以及部分酶学性质研究[D];四川大学;2002年
6 章小忠;纤维素硫酸钠制备工艺的放大和产纳豆激酶枯草杆菌微胶囊培养研究[D];浙江大学;2003年
7 胡升;新型溶栓酶——纳豆激酶的基础研究[D];浙江大学;2003年
8 倪剑锋;BN137菌株发酵产纳豆激酶的条件及酶的分离纯化、理化性质的研究[D];沈阳药科大学;2002年
9 温晓明;溶血栓作用的纳豆激酶基因导入莴苣植株的研究[D];广西大学;2003年
10 张利;纳豆激酶溶血栓作用及作用机理的研究[D];内蒙古农业大学;2003年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 胡景柱,夏寿华,吴林;纳豆冻干粉的安全性研究[J];安徽农业科学;2000年03期
2 范秉琳,朱武凌,邹国林,雒国胜,许春雷,赵卫星;人肝癌细胞差异表达基因纤维蛋白原γ-多肽的克隆与鉴定[J];癌症;2004年03期
3 路福平,王敏,王建玲,杜冰,杜连祥,李颖;血栓溶解酶产生菌及其培养条件的研究[J];氨基酸和生物资源;1997年02期
4 孙雷,黄仪秀,朱圣庚;噬菌体单链抗体导向溶栓剂的构建[J];北京大学学报(自然科学版);2000年06期
5 杨嘉树,蒋朋宸,茹炳根;一种导向性溶栓剂的基因构建及其在大肠杆菌中的表达[J];北京大学学报(自然科学版);1999年04期
6 谢文光,魏钰书,王会信,周良玉,周承富,蒋滋慧;活血化瘀中药的纤溶和纤溶抑制作用[J];中国医药学报;1996年06期
7 张洪基,肖昌华,唐绍宗,杨筠茹;尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒的分离及其生物活性的研究[J];动物学研究;1980年02期
8 叶智彰,涂光俦,冉永禄,于力,阮长耿,陈重坤,程大卫,严菊英,陈悦书;浙江产蝮蛇(Agkistrodon halys Pallas)蛇毒抗凝血活酶组份对凝血系统的作用[J];动物学研究;1981年01期
9 肖昌华,何丽芬,唐绍宗,杨筠茹,董馥明;尖吻蝮(Agkistrodon acutus) 蛇毒凝血酶样成分的研究Ⅰ.分离纯化及其理化特性的测定[J];动物学研究;1988年S1期
10 刘广芬;王晴川;陈清澄;刘必雄;;尖吻蝮(Agkistrodon acutus)蛇毒凝血酶样酶的分离、纯化及其生化药理研究[J];福建医科大学学报;1989年04期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 范晓丹;新型纤溶酶得产生菌选育、发酵优化及酶学性质研究[D];华南理工大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 武国栋;白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的分离纯化及酶学表征[D];大连理工大学;2006年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 向梅,杨金树,吴思方;豆豉纤溶酶的研究进展[J];武汉工业学院学报;2002年04期
2 向梅,吴思方,杨金树;豆豉纤溶酶的研究进展[J];中国酿造;2002年S1期
3 张少平;郭勇;;豆豉纤溶酶的分子生物学[J];生命的化学;2009年03期
4 孙月娥,钱和;豆豉纤溶酶生产菌发酵液功能性研究[J];江苏调味副食品;2005年05期
5 王卫东;孙月娥;;豆豉纤溶酶生产菌发酵液营养和活性成分分析[J];现代食品科技;2006年02期
6 张新;;豆豉纤溶酶的研究进展[J];安徽农业科学;2007年20期
7 马力;;豆豉纤溶酶的研究进展[J];肉类研究;2007年09期
8 刘柳;彭喜春;;纳豆激酶与豆豉纤溶酶酶学性质比较研究[J];中国酿造;2010年08期
9 孙月娥;王卫东;;豆豉纤溶酶的功能及应用前景[J];中国酿造;2010年09期
10 宋园亮;黄文宇;张忠华;吴少雄;殷建忠;柳陈坚;;云南传统发酵豆豉中高产豆豉纤溶酶菌株的筛选及其酶谱分析[J];生物技术通报;2011年05期
中国重要会议论文全文数据库 前8条
1 牟光庆;贾楠;邱泽文;刘坚;李瑶喜;霍贵成;;豆豉纤溶酶粗提液预防小鼠高血脂的研究[A];中国食品科学技术学会第五届年会暨第四届东西方食品业高层论坛论文摘要集[C];2007年
2 刘真真;茅文俊;朱虹;朱融融;孙晓宇;姚思德;汪世龙;;激光诱变筛选产木聚糖酶菌株以及木聚糖酶的性质研究[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2008年学术交流会论文摘要汇编[C];2008年
3 李红梅;梅乐和;Vlada Urlacher;Rolf D.Schmid;姚善泾;;催化吲哚生成靛蓝的细胞色素P450BM-3定向进化研究[A];浙江省生物化学与分子生物学学术交流会论文集[C];2005年
4 张琳丰;李念;张义正;冯红;;黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)环氧化物水解酶PchEHA结构与功能关系的研究[A];中国遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编(2004-2008)[C];2008年
5 刘云;张学清;王世春;徐琪寿;马立人;;代谢工程方法构建苯丙氨酸生物工程菌株[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
6 冯惠勇;仪宏;王丽丽;;一种新的耐热β-糖苷酶的研究[A];第七届全国酶学学术讨论会论文摘要集[C];2004年
7 赵晗;卢丽丽;范树泉;肖敏;;短双歧杆菌α-半乳糖苷酶Aga2催化位点定点突变研究[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
8 范树泉;赵晗;卢丽丽;肖敏;;定向进化技术提高α-半乳糖苷酶的转糖基效率[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
中国重要报纸全文数据库 前3条
1 何国庆 张灏;新酶种的开发和酶性能的改善(上)[N];中国食品报;2009年
2 王万枝;我国瓜类超低温育种获得成功[N];中国特产报;2001年
3 何国庆 张灏;基因工程 在酶制剂生产中的应用(上)[N];中国食品报;2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张少平;豆豉纤溶酶定向进化及突变酶基因的表达研究[D];华南理工大学;2010年
2 张旭;豆豉纤溶酶的纯化、生化特性研究及其体内外溶栓效果的评价[D];华中科技大学;2012年
3 范晓丹;新型纤溶酶得产生菌选育、发酵优化及酶学性质研究[D];华南理工大学;2006年
4 齐海萍;豆豉纤溶酶的制备、酶学特性及功能性质研究[D];江南大学;2004年
5 孙艳;点突变改造提高胆固醇氧化酶耐温性的研究[D];江南大学;2011年
6 李卫芬;热纤维梭菌β-葡聚糖酶热稳定性机制的研究[D];浙江大学;2005年
7 李红梅;细胞色素P450 BM-3体外定向进化及突变酶性能的研究[D];浙江大学;2006年
8 林涛;分子改造方法提高大肠杆菌天冬氨酸转氨酶热稳定性的研究[D];南京工业大学;2006年
9 钮利喜;工程菌生物转化D-氨基酸及其相关酶的研究[D];山西大学;2007年
10 胡升;面向靛玉红生物制备的细胞色素P450 BM-3半理性定向进化[D];浙江大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 关晨晨;豆豉纤溶酶的分离纯化、酶学性质的研究及微胶囊的制备[D];东北林业大学;2010年
2 刘雪;豆豉纤溶酶产生菌的筛选及基因的克隆与表达研究[D];山东师范大学;2011年
3 罗巅辉;α—乙酰乳酸脱羧酶的定向进化及低温条件下高活力突变酶的筛选[D];东北师范大学;2003年
4 王希春;固态发酵高溶栓活性豆豉及其抗氧化特性的研究[D];江南大学;2007年
5 刘孝龙;新型菊酯类农药降解酶的生化鉴定及分子改造研究[D];中山大学;2010年
6 廉虹;定点突变提高枯草杆菌脂肪酶A的对映体选择性[D];吉林大学;2008年
7 邹有土;扩展青霉脂肪酶的异源表达及分子突变[D];福建师范大学;2008年
8 虞青;细胞色素P450 BM-3定向进化研究[D];浙江大学;2008年
9 李运峰;末端氨基酸残基去除对黑曲霉木聚糖酶XynⅢ热稳定性影响[D];河南农业大学;2010年
10 蔡少丽;叠加突变改善扩展青霉脂肪酶的热稳定性[D];福建师范大学;2007年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026