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《华南理工大学》 2011年
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西梅籽β-葡萄糖苷酶的分离纯化、性质及固定化研究

陈磊  
【摘要】:近年来,β-葡萄糖苷酶因其在生物质转化、糖苷类化合物合成以及果汁、果酒增香中的重要应用而备受关注。本课题组的研究表明,西梅籽是一新型的β-葡萄糖苷酶来源,来源于西梅籽的粗酶在糖苷合成中表现出优异的催化性能。基于上述情况,本论文首次对来源于西梅籽的β-葡萄糖苷酶进行了分离纯化及相关酶学性质研究,并进一步考察采用交联酶聚集体(CLEAs)制备技术将其固定化以改善其催化特性的可能性。 来源于西梅籽的β-葡萄糖苷酶I相继经硫酸铵沉淀,疏水层析和阴离子交换层析后得到电泳纯的蛋白。SDS-PAGE和凝胶过滤层析测得该蛋白分子量分别为61和54 kDa。等电聚焦实验结果表明其pI值为5.0。以对硝基苯基β-D-葡萄糖苷(pNPG)水解反应为模式反应,该酶的最适pH及反应温度分别为5.5和55 oC,且其在广泛的pH范围内(pH 4.0-8.0)及45 oC以下均较为稳定。5 mM的Ag~+和Hg~(2+)可完全抑制该酶活力。抑制动力学研究发现,δ-葡萄糖酸内酯和葡萄糖对该酶的抑制常数分别为0.033和468 mM,表明该酶具有较高的葡萄糖耐受力。β-葡萄糖苷酶I催化pNPG和对硝基苯基β-D-岩藻糖苷(pNPF)水解反应的活力较高,其水解pNPG和pNPF的K_m值分别为3.51 mM (V_(max)=133.3μmol/min·mg)和1.54 mM (V_(max)=219.0μmol/min·mg)。但纤维二糖不是该酶的底物。 CLEAs技术作为一项无载体固定化技术,具有活力回收高、制备简便、生产成本低、单位质量催化剂酶活高及不易泄漏等诸多优点。制备该β-葡萄糖苷酶CLEAs的最适沉降剂及其浓度、最适交联剂(戊二醛)浓度及交联时间、还原剂(硼氢化钠)浓度分别为正丙醇、2/1 (v/v)、10 mM、2 h和20 mM。在上述条件下,CLEAs的活力回收率达75%。该法制备得到的CLEAs在pH 5.0和60 oC时具有最高的水解活力。该CLEAs的K_m值为5.62 mM (V_(max)=6.97μmol/min·mg),略高于西梅籽粗酶液(K_m=3.53 mM, V_(max)=5.41μmol/min·mg)和西梅籽粗粉(K_m =4.41 mM, V_(max)=0.17μmol/min·mg)。稳定性研究表明,在50 oC的水相体系中,西梅籽粗粉、CLEAs和粗酶液的半衰期分别为956、900及500 min;在90% (v/v)的叔丁醇体系中,50 oC下孵育15 h,粗酶液的残余活力仅有37%,而西梅籽粗粉和CLEAs在该温度下孵育72 h后残余活力仍分别达56%和44%,可见尽管CLEAs的稳定性略逊于西梅籽粗粉,却远优于粗酶液。在催化红景天苷的合成反应中,西梅籽粗粉和CLEAs连续使用3批次后,合成红景天苷总量相当,分别为0.40及0.46 g;然而,单位质量CLEAs催化红景天苷合成能力远高于西梅籽粗粉(0.33 vs. 0.02 mg/mL·mg),故CLEAs表现出绝对的生产优势。 对来源于西梅籽的β-葡萄糖苷酶进行分离纯化及相关酶学性质的研究,必将深化对β-葡萄糖苷酶的认识、丰富酶学基础理论知识,且将为该酶的广泛应用提供理论指导;另一方面,该酶的固定化研究无疑将进一步发掘其应用潜力。
【学位授予单位】:华南理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q814.2

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【参考文献】
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