收藏本站
《华南理工大学》 2012年
加入收藏

低剂量抗生素刺激条件下耐药基因水平传播的机制研究

鲁曦  
【摘要】：食品的安全性，不仅是民生大计，更是国家文明程度的重要象征。而食源性致病菌，作为食品安全最重要的风险因素之一已成为了全球性公共安全问题。而耐药基因在食物链中的传递在食品安全的研究中往往被忽略。由于抗生素在医疗领域和畜牧业中的大量使用，使一些残留抗生素随医疗垃圾和动物粪便流入到了环境当中并发生扩散，形成亚抑菌浓度的抗生素。然而，目前对于人们对于低剂量抗生素刺激下耐药基因水平传播的影响机制了解的尚不透彻，这限制了人们对于食源微生物中的耐药基因向人体传递这一潜在风险的认知。本研究从食品安全角度出发，以食源性致病菌作为研究对象，围绕耐药基因水平传播的机理及抑制方法进行了系统和深入的研究，首先在四种不同抑菌机制的抗生素的分别刺激条件下，研究了对大肠杆菌耐药基因水平传播效率的影响，发现在低于50%MIC（最小抑菌浓度）的环丙沙星、链霉素、氨苄西林的刺激条件对于耐药基因水平传播具有促进作用。随后利用蛋白质双向电泳技术，研究了亚抑菌浓度抗生素刺激条件下发生表达差异的蛋白，在所有差异蛋白中有7种与细菌耐药基因水平传播相关，分别是gspE、tesB、lexA、ftsZ、ftsY、kdsD、sul1。经过实时荧光定量PCR对编码上述7种蛋白的基因在RNA转录水平验证，证实了其中2个基因gspE、tesB在四种不同抑菌机制抗生素的分别刺激下均发生了差异表达，且变化趋势一致。然后通过构建gspE和tesB基因表达载体，并在大肠杆菌体内进行诱导，发现tesB基因高效表达时能够有效抑制耐药基因的水平传播（p0.01）；而gspE基因的高效表达具有促进耐药基因水平传播的作用（p0.01）。研究结果说明，tesB基因和gspE基因是大肠杆菌耐药基因水平传播的过程的关键基因。这一发现对于科学地缓解耐药基因水平传播、抑制耐药基因在食物链中的传递提供可行的研究方向。
【关键词】：食品安全 大肠杆菌 耐药基因 水平传播 亚抑菌浓度抗生素
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：TS201.6;R155.5
【目录】：
  • 摘要5-6
  • Abstract6-7
  • 英文缩写词表7-11
  • 第一章 绪论11-27
  • 1.1 食源微生物中耐药基因的安全性问题11-17
  • 1.1.1. 食源微生物中耐药基因的存在状况11-15
  • 1.1.2. 食源微生物中耐药基因的安全性问题15-17
  • 1.2 环境中的低剂量抗生素的分布17-21
  • 1.2.1 环境中低剂量抗生素的分布17-18
  • 1.2.2 低剂量抗生素对微生物的影响18-21
  • 1.3 细菌抗性机制及抗性基因的鉴定21-25
  • 1.3.1 耐药基因的移动机制21-22
  • 1.3.2 细菌耐药基因快速检测技术22-25
  • 1.4 本课题的研究意义及主要内容25-27
  • 1.4.1 研究背景及意义25-26
  • 1.4.2 主要研究内容26-27
  • 第二章 耐药基因快速检测平台的建立以及在食品样本检测中的应用27-37
  • 2.1 引言27-28
  • 2.2 实验材料与设备28-31
  • 2.2.1 菌株和耐药质粒28
  • 2.2.2 食品样本28
  • 2.2.3 主要试剂28
  • 2.2.4 主要仪器设备28
  • 2.2.5 实验引物28-31
  • 2.3 实验过程与方法31-32
  • 2.3.1 样品处理31
  • 2.3.2 耐药菌株分离培养31
  • 2.3.3 样本及菌株DNA提取31
  • 2.3.4 PCR方法扩增样本中的耐药基因31-32
  • 2.3.5 LAMP方法筛查样本中的耐药基因32
  • 2.4 结果与讨论32-36
  • 2.4.1 试验结果32-34
  • 2.4.1.1 食品样本中耐药菌株筛选计数32-33
  • 2.4.1.2 PCR法检测食源菌中的耐药基因33-34
  • 2.4.1.3 LAMP法检测食源菌中的耐药基因34
  • 2.4.2 讨论34-36
  • 2.5 本章小结36-37
  • 第三章 亚抑菌浓度抗生素刺激条件下耐药基因的水平传播规律研究37-51
  • 3.1 引言37
  • 3.2 实验材料与设备37-40
  • 3.2.1 主要仪器设备37-38
  • 3.2.2 主要试剂38
  • 3.2.3 实验质粒和菌株38-39
  • 3.2.4 常用溶液和培养基配制39-40
  • 3.3 实验过程与方法40-46
  • 3.3.1 实验流程40-41
  • 3.3.2 试验方法41-46
  • 3.4 结果与讨论46-50
  • 3.4.1 试验结果46-48
  • 3.4.2 讨论48-50
  • 3.5 本章小结50-51
  • 第四章 亚抑菌浓度抗生素刺激下耐药基因水平传播的比较蛋白质组学研究51-72
  • 4.1 引言51
  • 4.2 实验材料与设备51-55
  • 4.2.1 实验菌株51
  • 4.2.2 实验试剂51-54
  • 4.2.3 主要仪器设备54-55
  • 4.3 实验过程与方法55-62
  • 4.3.1 试验方法55-62
  • 4.4 结果与讨论62-70
  • 4.4.1 试验结果62-68
  • 4.4.2 讨论68-70
  • 4.5 本章小结70-72
  • 第五章 亚抑菌浓度抗生素刺激条件下耐药基因水平传播的转录水平研究72-89
  • 5.1 引言72
  • 5.2 实验材料与设备72-74
  • 5.2.1 实验样品72-73
  • 5.2.2 主要试剂73
  • 5.2.3 主要仪器设备73-74
  • 5.3 实验过程与方法74-77
  • 5.3.1 样品RNA提取74-75
  • 5.3.2 样品RNA琼脂糖电泳75
  • 5.3.3 RNA的逆转录75-76
  • 5.3.4 荧光定量PCR76-77
  • 5.3.5 数据分析与处理77
  • 5.4 结果与讨论77-87
  • 5.4.3 RNA提取结果77-78
  • 5.4.4 荧光定量PCR特异性验证78-83
  • 5.4.5 实时荧光定量PCR试验结果83-86
  • 5.4.6 讨论86-87
  • 5.5 本章小结87-89
  • 第六章 大肠杆菌耐药基因水平传播的机制研究89-120
  • 6.1 引言89
  • 6.2 材料与方法89-95
  • 6.2.1 主要仪器设备89-90
  • 6.2.2 主要试剂和耗品90
  • 6.2.3 菌株90
  • 6.2.4 培养基和常用溶液配制90-95
  • 6.2.5 引物95
  • 6.3 实验方法95-105
  • 6.3.1 克隆载体pMD18-gspE和pMD18-tesB的构建95-99
  • 6.3.2 表达载体pET19b-gspE和pET19b-tesB的构建99-100
  • 6.3.3 E. coli GSPE-E 和E. coli TESB-E表达产物鉴定及诱导条件优化100-104
  • 6.3.4 工程菌E. coli TESB-E和E. coli GSPE-E感受态细胞的制备104
  • 6.3.5 R388 质粒分别转化工程菌E. coli TESB-E和E. coli GSPE-E104
  • 6.3.6 工程菌E. coli TESB-E和E. coli GSPE-E的诱导104
  • 6.3.7 低剂量抗生素刺激条件下耐药基因水平传播实验104
  • 6.3.8 无抗生素刺激条件下耐药基因水平传播实验104-105
  • 6.3.9 整合效率测定105
  • 6.4 结果与讨论105-118
  • 6.4.1 克隆载体pMD18-tesB和pMD18-gspE的验证结果105-107
  • 6.4.2 表达载体pET19b-tesB和pET19b-gspE的构建与验证107-112
  • 6.4.3 Western blot对E. coli TESB-E 和E. coliGSPE-E表达产物鉴定及诱导条件优化112-114
  • 6.4.4 诱导tesB基因高效表达对耐药基因水平传播效率的影响114-116
  • 6.4.5 诱导gspE基因高效表达对接合效率的影响116-118
  • 6.5 本章小结118-120
  • 结论与展望120-124
  • 结论120-122
  • 创新之处122-123
  • 展望123-124
  • 附录 1124-133
  • 附录 2133-147
  • 附录 3147-148
  • 附录 4148-149
  • 附录 5149-150
  • 附录 6150-151
  • 参考文献151-163
  • 攻读博士学位期间取得的研究成果163-166
  • 致谢166-168
  • 附件168

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 ;“有抗奶”:百姓身边的隐形杀手[J];科学生活;2006年09期
2 冯洁;李琳;石磊;;高强脉冲电场对食品中大肠埃希氏菌基因水平传递的影响[J];食品科技;2007年03期
3 王兰;;抗生素污染现状及对环境微生态的影响[J];药物生物技术;2006年02期
4 潘露;胡晓清;王小元;;食品中乳酸菌危害因子的研究进展[J];食品工业科技;2011年06期
5 李霞;张宏伟;郑文杰;黄金海;;耐甲氧西林葡萄球菌mecA基因的LAMP检测方法研究[J];食品研究与开发;2011年08期
6 张丽芳;;细菌的耐药性[J];河北化工;2011年08期
7 陆素颖;李天宇;周宏伟;;头孢噻肟处理的城市河流沉积物微生物群落结构及bla_(CTX-M)多样性的研究[J];南方医科大学学报;2010年03期
8 刘伯宁;;面对“超级细菌”,我们怎么办[J];中国减灾;2010年23期
9 刘健华;陈杖榴;;食品动物源细菌耐药性与公共卫生[J];中兽医医药杂志;2008年01期
10 陈飞,戴先礼,肖国平,姚永华;食品中药物残留的危害及控制[J];动物科学与动物医学;2003年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 李国明;陈群;陈军剑;樊翌明;;淋病奈瑟菌耐药基因型与多重耐药关系的研究[A];第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编[C];2004年
2 莫非;;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因及消毒剂耐药相关基因的检测[A];第五次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2006年
3 金玉莲;王庆;张小刚;王仲元;;中国部分地区耐利福平和异烟肼耐药基因的检测[A];2004年中国防痨协会临床基础专业委员会学术会议论文集[C];2004年
4 蒋燕群;韩立中;奚伟;汤瑾;王坚强;倪语星;;两株阴沟肠杆菌的DHA-1型耐药基因的转移方式探讨[A];第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编[C];2004年
5 许景峰;徐琳;;产ESBLs菌株Ⅰ类整合子分布与耐药基因的研究[A];2009年中国药学大会暨第九届中国药师周论文集[C];2009年
6 李智山;赵建忠;周乐翔;杨燕;邓三季;邹玖明;;国内首次从大肠埃希菌发现blaCTX-M-55型超广谱β内酰胺酶基因[A];湖北省暨武汉市微生物学会分析微生物专业委员会第十届第五次学术会议论文汇编[C];2008年
7 羊云飞;王红宁;马孟根;李成忠;;三重PCR检测致病性大肠杆菌、沙门氏菌对氯霉素类抗生素耐药基因(Cat1、CmlA、Flor)的研究[A];人畜共患传染病防治研究新成果汇编[C];2004年
8 邓丽华;许美荣;胡丽萍;;铜绿假单胞菌的耐药性及β-内酰胺酶基因的研究[A];第五次全国中青年检验医学学术会议论文汇编[C];2006年
9 张之文;王红宁;代敏;李春;;PCR技术检测沙门氏菌链霉素、卡那霉素耐药基因(aadA、aadB)的研究[A];人畜共患传染病防治研究新成果汇编[C];2004年
10 冯忻;陈汉奎;吴秋良;侯锦辉;;卵巢肿瘤组织中P-糖蛋白的表达及临床意义[A];2000全国肿瘤学术大会论文集[C];2000年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 王其玲 李水根;抗生素新耐药基因被捕获[N];健康报;2003年
2 陈英云 乔蕤琳;我省专家首次确立控制耐药基因表达研究思路[N];黑龙江经济报;2010年
3 记者 郭静 通讯员 郝黎 张丹娜;肺癌耐药基因找到了[N];广东科技报;2010年
4 记者 陈枫;超级细菌蔓延?实为“耐药基因”![N];南方日报;2010年
5 张田勘;终止对牲畜用药的绿色之途[N];科技日报;2003年
6 张田勘;终止对牲畜用药的绿色之途[N];人民政协报;2003年
7 张田勘;抗生素 三级忧虑[N];科技日报;2002年
8 ;食品药物残留的危害及控制[N];中国国门时报;2003年
9 记者 陈枫 通讯员 郝黎 张丹娜;肺癌治疗有效率达93%[N];南方日报;2010年
10 记者 马晓华;我国发现三例耐药细菌携带者[N];第一财经日报;2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 金鑫;亚治疗剂量四环素饲喂对牛源微生物耐药基因的影响[D];内蒙古农业大学;2012年
2 鲁曦;低剂量抗生素刺激条件下耐药基因水平传播的机制研究[D];华南理工大学;2012年
3 鲁玉侠;食源微生物耐药基因水平传播抑制研究[D];华南理工大学;2010年
4 胡立芬;安徽省临床分离的嗜麦芽窄食单胞菌的耐药性变迁及相关耐药机制[D];安徽医科大学;2011年
5 毛锦龙;Ⅱ-Ⅲ级星型细胞瘤体外诱导耐药细胞—干细胞基因及耐药基因研究[D];北京协和医学院;2010年
6 毕水莲;奇异变形杆菌可移动耐药基因岛研究[D];华南理工大学;2011年
7 马孟根;猪源致病性沙门氏菌耐药基因PCR和基因芯片检测技术研究[D];四川大学;2005年
8 李楠;养殖场空气中细菌分布及耐药性研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年
9 许尚臣;颞叶内侧癫痫/海马硬化外科治疗及神经细胞凋亡、耐药基因表达研究[D];山东大学;2007年
10 金文杰;禽致病性大肠杆菌耐药基因和毒力因子的分子流行病学及HPI Irp1细胞表位作用的研究[D];扬州大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 傅雅丽;耐药基因及病原体高通量检测芯片的研制及初步应用[D];南京医科大学;2012年
2 王卉;四川地区鸭源大肠杆菌流行病学研究及其耐药表型和耐药基因相关性分析[D];四川农业大学;2012年
3 潘鑫;山东省高密地区鸭源大肠杆菌的分离鉴定及耐药基因检测[D];山东农业大学;2012年
4 何建华;一株多重耐药单核细胞增生李斯特菌的耐药基因分析[D];华南理工大学;2013年
5 丛莉;鱼塘生态体系沙门氏菌的耐药性及耐药基因分析[D];暨南大学;2011年
6 王媛媛;C.jejuni毒力及耐药基因的分析和粪便中的C.jejuni快速鉴定[D];河北医科大学;2013年
7 姚岚;皮肤感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性研究及耐药基因的检测[D];新疆医科大学;2011年
8 余晓龙;四川地区鸭源沙门氏菌分离与血清型分析及其药敏性与耐药基因相关性研究[D];四川农业大学;2012年
9 董睿;鸡蛋源沙门菌的分离鉴定及其耐药基因和毒力基因的检测[D];西北农林科技大学;2012年
10 马婧嘉;沙门氏菌耐药质粒及其耐药基因的筛查[D];上海交通大学;2013年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026

《中国学术期刊（光盘版）》电子杂志社有限公司
同方知网数字出版技术股份有限公司
地址：北京清华大学 84-48信箱 大众知识服务
京ICP证040441号
互联网出版许可证 新出网证（京）字008号
出版物经营许可证 新出发京批字第直0595号

订购热线：400-819-9993 010-62982499
服务热线：010-62985026 010-62791813
在线咨询：http://help.cnki.net
传真：010-62780361
京公网安备11010802020475号