基于稳定性同位素探测技术的养殖水体氮素循环微生物的多样性研究

【摘要】：氮素循环是生物地球化学中重要的元素循环，对虾养殖环境是一个典型的氮素循环系统，氮的化合物（氨态氮和亚硝态氮等）对养殖生物具有毒害作用，制约着养殖业的健康发展。本文针对珠三角地区典型对虾养殖水体中的氮素循环微生物建立和优化了15N-稳定性同位素探测技术平台，构建了两个微宇宙，分别以两种标记底物对养殖水体微生物进行标记，并结合PCR-DGGE技术监测了标记培养过程中三种典型氮素循环微生物群落结构的变化，最后基于两个微宇宙回收的~(15)N-DNA，分别构建了细菌和古菌的16SrRNA基因克隆文库，获取了丰富的养殖水体氮素循环微生物的基因信息，综合分析了其多样性，得到的主要结论如下： 1.大肠杆菌纯培养~14N-DNA和~(15)N-DNA的标记、分离与离心条件优化实验证明，在现有的实验硬件条件下，~(15)N-DNA-SIP技术是可行的。基于~(15)N-DNA-SIP，对三种氮素迁移微生物的群落结构变化的DGGE监测结果表明，几乎所有样品均反映出群落结构分布随时间推移产生了连贯性的变化规律，并与氮素化合物的变化特征具有一定的相关性。以上结果表明，~(15)N-DNA-SIP技术适用于养殖水体氮素循环微生物的多样性研究，同时确定本研究中最佳标记时间为12天，进行下一步研究。 2.以~(15)NH_4~+-SIP微宇宙中标记12天的~(15)N-DNA为模板，构建了细菌和古菌16SrRNA基因克隆文库（~(15)NH_4~+-SIP克隆文库），RFLP和BLAST分析结果表明：细菌文库得到的19个OTUs分别归为β-变形菌纲（β-proteobacteria）（53.7%）、γ-变形菌纲（γ-proteobacteria）（32.2%）、α-变形菌纲（α-proteobacteria）（13.3%）和浮霉菌门（Planctomycetes）（0.8%）；古菌文库得到9个OTUs，主要由奇古菌门（Thaumarchaeota）（53.8%）、泉古菌门（Crenarchaeota）（34.7%）和广古菌门（Euryarchaeota）（11.5%）组成。 3.以15NO2--SIP微宇宙中标记12天的~(15)N-DNA为模板，构建了细菌和古菌16S rRNA基因克隆文库，RFLP和BLAST对分析结果表明：细菌文库由β-proteobacteria（39.7%）、γ-proteobacteria（37.2%）、α-proteobacteria（17.4%）、放线菌门（Actinobacteria）（4.1%）和厚壁菌门（Firmicutes）（1.6%）组成，得到的24个OTUs中有9个未在~(15)NH_4~+-SIP细菌文库中出现；古菌文库主要由Thaumarchaeota（44.9%）、Crenarchaeota（30.8%）和Euryarchaeota（24.4%）组成，得到的11个OTUs中有7个曾出现于~(15)NH_4~+-SIP古菌文库中。 4.对全文所构建的4个15N-SIP-16S rRNA基因克隆文库进行综合分析，结果表明：文库中氨氧化菌、硝化菌和反硝化菌群的克隆子比例较均衡，固氮菌群较少，反硝化菌群种类最丰富。将~(15)NH_4~+-SIP人工培养基标记法和15NO2--SIP半原位标记法有机结合，互补优劣，能得到更丰富的养殖水体中氮素循环微生物的基因信息，能更准确地分析该水体环境中氮素循环微生物的群落结构与功能的关系。