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《华南理工大学》 2011年
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基于木质纤维素水解液的发酵性丝孢酵母发酵产油脂的研究

黄超  
【摘要】:微生物油脂是产油微生物在一定条件下于体内合成积累的油脂,其脂肪酸组成与一般植物油脂相似,且生产周期短,不受场地和季节限制,故为生物柴油的良好原料。目前,用于生产微生物油脂的合成培养基成本较高,限制了其大规模生产与应用。木质纤维素是自然界中数量最多、来源最广、并可再生的绿色资源,利用木质纤维素水解液发酵产油脂可望降低其生产成本。然而,木质纤维素水解液的主要成分为葡萄糖和木糖,而木糖一般难以被微生物所利用;并且,木质纤维素在稀酸水解或预处理过程中会产生许多抑制微生物细胞生长与产物形成的副产物(抑制剂),如有机酸、醛类和醇类化合物等。因此,唯有获得可高效利用木糖产油脂的微生物菌株,并掌握木质纤维素水解液中各种抑制剂对油脂微生物细胞生长和油脂积累的抑制规律及其机理,采取针对性的策略解除或部分解除其抑制作用,方能有效利用木质纤维素水解液生产微生物油脂。值得注意的是,油脂微生物利用木质纤维素水解液发酵产油脂以及木质纤维素水解液中抑制剂对油脂微生物细胞生长与油脂积累抑制规律及其机理的研究却鲜有报道。 本课题组已筛选到一株能够利用葡萄糖和木糖产油脂的发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans),但该酵母在未经脱毒的水稻秸秆稀酸水解液中生长不良,用其进行油脂发酵,油脂得率仅为1.7g/L,远低于其在葡萄糖或木糖培养基中发酵的相应结果(13.6g/L和9.9g/L)。有鉴于此,本论文首先利用水稻秸秆稀酸水解液对发酵性丝孢酵母进行驯化,提高该菌株对木质纤维素水解液中抑制剂的耐受性;接着对比研究不同水解及脱毒方法对木质纤维素水解液组成的影响,并以该水解液为培养基,以驯化后的发酵性丝孢酵母为研究对象,探讨其利用木质纤维素水解液发酵产油脂的可行性,研究不同因素对发酵性丝孢酵母利用木质纤维素水解液发酵产油脂的影响规律,建立基于木质纤维素水解液的发酵产脂体系;随后研究木质纤维素水解液中三类不同代表性的抑制剂(有机酸、醛类物质与醇类物质)对发酵性丝孢酵母细胞生长与油脂积累的影响规律,并进而考察上述三类抑制剂对发酵性丝孢酵母糖代谢、苹果酸酶活力、细胞形态与细胞膜完整性的影响,以初步阐明木质纤维素水解液中抑制剂对发酵性丝孢酵母细胞生长与油脂积累的抑制机理。 以华南地区常见的两种木质纤维素(水稻秸秆与甘蔗渣)为原料,考察发酵性丝孢酵母在其稀酸水解液中的发酵产脂情况。研究表明,选择适当的脱毒方法能显著降低水解液中抑制剂的浓度,在依次使用过石灰化、浓缩、大孔树脂Amberlite XAD-4吸附处理过的水稻秸秆稀酸水解液中,发酵性丝孢酵母能够较好地发酵产油脂,发酵8天后的油脂得率可达11.5g/L。而由活性炭取代大孔树脂Amberlite XAD-4作为吸附剂对木质纤维素水解液的脱毒效果影响甚微,但大大降低了脱毒成本。以经过活性炭脱毒的甘蔗渣稀酸水解液为培养基的发酵产脂研究表明,发酵时间、接种量、初始pH是影响发酵性丝孢酵母产脂的关键因素;在最适条件下(接种量10%,蛋白胨1.8g/L,初始pH值7.5,温度25℃,发酵9天),生物量、油脂含量、油脂得率可达33.7g/L,44.9%与15.1g/L。 为了实现木质纤维素资源的综合利用,在稀酸预处理基础上,采用酶法进一步水解固体残渣中的纤维素成分,得到水稻秸秆完全水解液。与其稀酸水解液相比,水稻秸秆完全水解液中的初始糖浓度较高,抑制剂浓度较低,脱毒只需简单的过石灰化,因而简化了脱毒步骤。研究表明,该水解液只需外加少量氮源和微量CuSO4·5H2O即可满足发酵性丝孢酵母细胞生长和油脂积累的营养要求;在优化条件下(接种量5%,初始pH值7.0,温度25℃,发酵7天),发酵性丝孢酵母的生物量、油脂含量与油脂得率分别为26.4g/L,52.2%和13.8g/L。以水稻秸秆完全水解液为培养基可缩短发酵产脂周期,其原因可能是该水解液中大部分可发酵性糖为葡萄糖,有利于发酵性丝孢酵母细胞的代谢,从而提高了发酵效率。 上述研究表明,无论在甘蔗渣稀酸水解液或水稻秸秆完全水解液中,发酵性丝孢酵母的油脂得率系数均低于不含抑制剂的培养基(对照)中的对应值(13.9%,17.0%vs20.6%),说明木质纤维素水解液中的抑制剂对发酵性丝孢酵母的产脂过程产生了抑制;同时,发酵条件(接种量、初始pH等)对发酵性丝孢酵母在木质纤维素水解液或无抑制剂的培养基(对照)中细胞生长与油脂积累的影响规律各异,表明发酵条件亦是影响抑制剂抑制作用的重要因素。 为了掌握不同种类抑制剂对发酵性丝孢酵母细胞生长与油脂积累的影响规律,本论文以木质纤维素水解液中典型的10种有机酸(乙酸、甲酸、乙酰丙酸、己酸、4-羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、糠酸、没食子酸与阿魏酸)、5种醛类物质(糠醛、5-羟基甲基糠醛、香草醛、丁香醛与4-羟基苯甲醛)和4种醇类物质(邻苯二酚、对苯二酚、糠醇与香草醇)等19种抑制剂为研究对象,考察它们对发酵性丝孢酵母发酵产脂过程的影响。结果表明:抑制剂对发酵性丝孢酵母细胞生长与油脂积累的抑制作用与其疏水性无相关性,这与其它文献报道,即抑制剂对产乙醇微生物或其它油脂微生物的毒性与其疏水性呈正相关的规律不一致,表明疏水性并非决定抑制剂毒性的唯一因素。在所研究的三类抑制剂中,有机酸对发酵性丝孢酵母细胞的毒性最小,醇类物质次之,而醛类物质的毒性最大,但抑制剂对发酵性丝孢酵母油脂脂肪酸组成的影响甚微。在低浓度下,大部分抑制剂对发酵性丝孢酵母细胞生长与油脂积累影响不大。有趣的是,部分有机酸,如乙酸、甲酸、乙酰丙酸、4-羟基苯甲酸与没食子酸,在低浓度下甚至能促进发酵性丝孢酵母的细胞生长,而糠酸与香草醇在一定浓度下则对发酵性丝孢酵母的油脂合成有促进作用。对比研究发现,在糠醇、糠酸与糠醛这三种含呋喃环的结构类似物中,糠酸对发酵丝孢酵母的毒性最小,在低浓度下糠醛的毒性要略低于糠醇的,但发酵性丝孢酵母能够耐受更高浓度的糠醇;香草醇、香草酸与香草醛这三种含苯环的结构类似物中,香草酸对发酵性丝孢酵母的毒性最小,而香草醛的毒性最大。 木质纤维素水解液中往往同时存在多种抑制剂,因此进一步研究了抑制剂之间对发酵性丝孢酵母细胞生长与油脂积累的协同作用。结果表明,除了芳香族醛类物质之间,邻苯二酚与香草醇或与对苯二酚之间,以及乙酸与没食子酸之间的两两结合外,大部分抑制剂之间的两两结合均无协同抑制作用。响应面法研究表明:乙酸、糠醛与邻苯二酚单独存在时均会降低发酵性丝孢酵母的生物量、油脂得率与糖消耗量;有趣的是,乙酸与邻苯二酚的组合却对上述变量有促进作用,而其它抑制剂间的两两组合或三者并存对发酵性丝孢酵母的生物量、油脂得率与糖利用则无显著影响。 为了有效降低或消除抑制剂的毒性,本研究系统探讨了发酵条件对木质纤维素水解中不同抑制剂的抑制作用之影响规律。结果表明,提高接种量可以减小大部分抑制剂(包括脂肪族有机酸、所有醛类物质以及醇类物质中邻苯二酚)对细胞的毒性。尽管温度与初始pH值对抑制剂抑制作用的影响无规律性,但改变温度与初始pH值亦能减轻或者消除抑制剂对发酵性丝孢酵母细胞生长与油脂积累的抑制作用,具体效果因抑制剂不同而异。因此,在实际应用中,可根据木质纤维素水解液中抑制剂的种类与浓度进行发酵条件的优化。 在明了抑制剂对发酵性丝孢酵母细胞生长与油脂积累影响规律的基础上,进一步研究其对发酵性丝孢酵母糖代谢、苹果酸酶活力、细胞膜完整性以及细胞形态的影响,以初步阐明不同抑制剂的抑制机理。结果表明,部分有机酸和醇类物质在低浓度下能促进发酵性丝孢酵母对糖的利用,一定程度上解释了这些物质在低浓度下对发酵性丝孢酵母细胞生长或油脂合成有促进作用的现象。在其IC25浓度(抑制25%油脂得率的浓度)下,抑制剂在发酵初期均对发酵性丝孢酵母的葡萄糖与木糖代谢产生抑制作用,导致细胞生长的迟滞期延长,油脂合成推迟;而在发酵后期,某些芳香族或者呋喃类抑制剂能促进木糖代谢,但对木糖利用的增加却未促进其细胞生长与油脂积累。苹果酸酶是油脂合成途径中的关键酶,其主要作用是提供油脂合成所需的还原力NADPH。在所测的19种抑制剂中,除糠酸、香草醇、香草醛与5-羟基甲基糠醛外,其余抑制剂均对发酵性丝孢酵母的苹果酸酶活力产生了抑制作用。特别地,糠酸与香草醇对苹果酸酶的活力有促进作用,部分解释了它们在一定浓度下能够促进发酵性丝孢酵母油脂积累的现象。 除了对糖代谢及代谢途径关键酶的活力产生影响外,抑制剂还会攻击细胞膜的疏水位点,破坏其完整性进而影响微生物细胞的生理生化活性。利用碘化丙啶(PI)染色与流式细胞仪检测分析抑制剂对发酵性丝孢酵母细胞膜完整性的影响,结果表明,在所测的19种抑制剂中,除了阿魏酸、己酸与香草醇外,其余抑制剂均会破坏细胞膜的完整性。抑制剂对发酵性丝孢酵母细胞膜完整性的破坏与其疏水性无相关性,部分解释了上述抑制剂毒性与其疏水性无相关性的现象。抑制剂还会使发酵性丝孢酵母的细胞形态发生改变,但细胞形态的改变与其对发酵性丝孢酵母细胞生长与油脂积累的影响亦无相关性。酵母在乙醇发酵中把糠醛还原为糠醇、糠醇是其自身脱毒的终产物;而发酵性丝孢酵母在油脂发酵过程中对糠醛具有其独特的脱毒机制:糠醛先在短时间内被还原为糠醇,随后糠醇慢慢转化为糠酸,糠酸是其自身脱毒的终产物。综上所述,抑制剂对发酵性丝孢酵母细胞生长与油脂积累的抑制途径主要包括对糖代谢、苹果酸酶活力产生抑制作用,以及破坏细胞膜的完整性等。 本研究初步阐明了木质纤维素水解液中不同抑制剂对发酵性丝孢酵母细胞生长与油脂积累的影响规律及其机理,为后续菌株改造,发酵与脱毒过程优化提供了理论依据;而发酵性丝孢酵母基于不同木质纤维素水解液发酵产脂体系的建立,可望降低微生物油脂的成本,为生物柴油提供可持续供应的油脂原料。
【学位授予单位】:华南理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:TQ920.6

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