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《华南理工大学》 2013年
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ZEN降解酶A4-Prx在酵母中的分泌表达及其应用研究

肖俊梅  
【摘要】:玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN,ZEA)是一种由镰刀菌属产生的具有雌激素毒性的真菌毒素,由于ZEN具有生殖发育毒性、免疫毒性以及肿瘤诱发性,易导致动物和人生殖系统发生紊乱,对人和动物的健康有潜在危害,所以日益受到重视。目前,为了减少食品和饲料中残留的ZEN及其衍生毒素对农业和养殖业带来的损失,国内外研究人员开发了物理、化学和生物各类脱毒方法。物理法和化学法脱毒效率低,且破坏原料的营养成分,并带来环境污染;而生物转化法可彻底把ZEN降解转化成为无毒的物质,是一种真正意义上的脱毒方法。本实验室已分离的不动杆菌Acinetobacter sp. SM04可将ZEN降解成极低雌激素活性的无毒产物,本论文主要致力于将Acinetobacter sp. SM04中有降解ZEN作用的关键酶A4-Prx的基因在酵母系统中进行分泌表达研究,包括诱导条件优化、重组蛋白A4-Prx降解ZEN的活性测定及其应用于ZEN污染食品和酒精糟中的脱毒效果等。 本论文成功构建了重组分泌表达载体pYα-A4-Prx和pPIC9K-A4-Prx,将其分别转化至酿酒酵母INVSc1和毕赤酵母GS115表达宿主中,构建重组酿酒酵母INVSc1/pYα-A4-Prx和重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-A4-Prx,两者均成功分泌表达得到ZEN降解酶A4-Prx。重组酿酒酵母INVSc1/pYα-A4-Prx的A4-Prx表达量约70.00mg/L,蛋白分子量约20kDa,对ZEN的降解率为47.50%;重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-A4-Prx的A4-Prx表达量约75.97mg/L,SDS-PAGE电泳显示蛋白分子量约为41kDa(A4-Prx可能形成二聚体),对ZEN的降解率为48.00%。 本论文选取重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-A4-Prx,单因子实验中,进行单因素表达条件优化实验,确定了各因素的优化范围:pH为6.0~8.0,温度为30℃;而且,不同氨基酸的添加会促进蛋白的表达,其中Gly、Lys和Ala三种氨基酸的添加效果较好,最佳浓度为0.10%;此外,尝试添加蛋白酶抑制剂EDTA (10mmol/L),虽可使重组蛋白A4-Prx的表达量略有增加,但其对ZEN的降解效果却大大降低了。 本论文进一步采用响应面分析法,研究了pH、温度和Gly浓度对重组蛋白A4-Prx表达的影响。结果表明,当pH为7.0、添加Gly浓度为0.11%、温度为30℃时,重组蛋白A4-Prx的表达量最高,达到130.39mg/L,ZEN降解率为78.44%,相对于优化前对照组均提高近一倍。 本论文对污染较严重的几种市售食品以及玉米酒精糟DDGS应用重组蛋白A4-Prx进行ZEN降解实验。结果表明,重组酶A4-Prx对不同程度ZEN污染的食品均有高效降解ZEN的能力,且对ZEN污染最严重的醋和酱油的降解率接近80.00%,对DDGS的降解率为83.45%。 针对ZEN生物降解关键酶A4-Prx,本论文采用基因工程研究方法,成功地构建了重组酵母INVSc1/pYα-A4-Prx和GS115/pPIC9K-A4-Prx,两者均成功表达得到重组蛋白A4-Prx,对ZEN都显示出接近50.00%的降解率;对重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-A4-Prx进行表达条件优化,当培养基pH7.0、添加0.11%Gly、30℃诱导时,重组蛋白A4-Prx的表达效率可提高近一倍,达到130.39mg/L,ZEN降解率78.44%;将其应用于市售食品和DDGS的ZEN降解实验,获得显著效果,为研究控制食品中ZEN污染奠定了基础。
【学位授予单位】:华南理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:TS207

【参考文献】
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