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抗二型登革热病毒非结构蛋白1的单域重链抗体和单克隆抗体的制备及应用于免疫检测的比较研究

ANEELA FATIMA(发提玛)  
【摘要】:由于登革热病例在全球范围内呈逐年上升的态势,而且目前尚未开发出相关疫苗,因此,早期、快速且经济的检测方法成为了攻克这一疾病的唯一途径。而在现阶段,对登革热的检测仍是一个悬而未决的问题。NS1是二型登革热病毒基因组中第一个被转录的非结构糖蛋白。现已发现,在患者出现临床症状后的1到9天之内即可检测出NS1的可溶性血清抗原。无论是初次感染还是再次感染患者,其NS1血清抗原都在第3到5天达到最高值。这些特性使NS1成为了一种极有价值的分子标记,用于快速诊断试剂盒的开发。我们采用大肠杆菌表达体系成功表达并获得了具有保守结构特征的可溶性rNS1蛋白。进而,又通过荧光光谱及圆二色谱对这些rNS1蛋白的保守结构区域进行了鉴定和验证。总之,这些结果显示了重组rNS1蛋白保留了天然病毒蛋白的主要构造特征及抗原决定簇,因此对于诊断试剂盒的开发具有重要意义。 抗体已被广泛用于各种诊断及免疫疗法中。采用传统的杂交瘤技术生产针对rDENV2-NS1的血清型特异的单克隆抗体,基于所分泌单抗与rNS1蛋白的强阳性反应,共筛选出了18株稳定生产单抗的杂交瘤细胞株。由于单抗3B3与其它含组氨酸标签的蛋白无交互作用,并在间接ELISA实验中显示了强反应活性,因此我们选择了这一单抗与VHH抗体进行比较。但由于克隆及筛选过程的复杂性,这一传统的基于杂交瘤技术的单抗生产方法成本高且周期长,因此主要还是用于实验室研究。 骆驼科重链抗体的研究为我们在免疫学和生物技术领域提出了一个全新的概念。我们在实验中使用美洲驼非免疫VHH(单结构域抗体片段)库,建立了一个快速、可靠且可控的筛选VHH抗体的方法。通过生物淘洗噬菌体展示的美洲驼非免疫文库并在大肠杆菌中表达纯化,筛选并生产了抗二型登革热病毒rNS1蛋白的VHH抗体。对VHH抗体的序列分析揭示了具有高抗原特异性的全新CDR3区域。我们以解离速率常数(KD)作为检验亲和力的指标,得到的VHH抗体P2与rNS1的亲和力常数为2.79×10-8(处于大多数VHH与抗原结合的KD值范围之内),而单克隆抗体3B3的亲和力常数则为5.74×10-6。 进而,我们通过表位绘图的方法对VHH抗体以及单克隆抗体所识别的相同及不同抗原表位进行了比较。我们分别以VHH抗体和单抗为靶标,使用噬菌体展示肽文库的方法对它们的抗原表位进行了筛选。有趣的是,NS1蛋白所包含的一段高保守的氨基酸序列表位224HWPKPHTLW232与两种抗体都具有高亲和力。这一rNS1序列的同源区(224-232)包含了两个关键的抗原表位元件组氨酸-色氨酸-色氨酸和色氨酸-脯氨酸-色氨酸。因此,这两种抗体具有共同的针对rNS1抗原表位的这一信息,使我们可以在血清学诊断测试中对它们的亲和活性进行比较。我们由此开发出了基于免疫层析法的快速诊断试剂盒,并进而对这两种抗体进行了亲和力比较研究。结果显示,VHH抗体较单抗具有更高的敏感性及更强的特异性,这可能是由于VHH抗体具有较长的CDR3区,并因此增强了其与目标抗原的袋状或裂隙内位点的结合能力。因此,由大肠杆菌所生产的VHH抗体在开发用于对抗登革热病毒感的检验工具时比单克隆抗体更为经济有效。


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