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《华南理工大学》 2014年
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葡萄藻原生质体制备与评价方法研究

熊爽  
【摘要】:生物燃料(Biofuels)是替代化石燃料的理想能源,具有安全、环保和可再生等优点。绿藻—葡萄藻属(Botryococcus)的很多品种因其含有大量的可替代化石燃料的碳氢化合物(烃类)而受到广泛关注,但高产烃的布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)生长很慢、生物量产量低,其他种葡萄藻的碳氢化合物种类和含量差异很大,使得葡萄藻属绿藻的能源化开发利用受到极大限制。本文在系统比较葡萄藻(Botryococcus sudeticusUTEX2629)和葡萄藻(Botryococcus sp. CCMP2742)的生长和能源物质(烃类、脂肪酸)含量的基础上,选择以UTEX2629为研究对象,通过方法学研究优化原生质体的制备条件和制备率的检测方法,创建了葡萄藻原生质体制备和评价的新技术体系。主要实验结果如下: 1.单细胞态的葡萄藻UTEX2629在Modified Bold3N培养基中自养生长良好,第27天时细胞密度达到最大(1.0×107/mL),平均比生长速率为0.19d-1。集落状态的葡萄藻CCMP2742在含有2g/L KNO3的DV-Y培养基中生长良好,绿色细胞在第19天时达到最大细胞浓度(7.5×106/mL),平均比生长速率为0.17d-1。 2.利用GC-MS分析对数期细胞的能源物质(脂肪酸和碳氢化合物)的组成和含量,发现葡萄藻UTEX2629的能源成分总量随细胞生长(OD690值)而升高,在对数后期(OD6901.5时)脂肪酸和碳氢化合物含量分别达干重的5.13%和5.48‰。葡萄藻CCMP2742脂肪酸含量随细胞生长而升高,但碳氢化合物含量则随细胞生长先增大后减小,在对数后期(OD6901.3时)总脂肪酸含量最高,为11.97%干重。在对数后期(OD690为1.1时)碳氢化合物含量最高,为7.72‰干重。综合比较表明,葡萄藻UTEX2629生长快、单细胞态、对数期长、分泌物少,更适合作为原生质体制备的材料。 3.以对数中期的葡萄藻UTEX2629细胞为材料,系统评价了三种葡萄藻原生质体制备率的测定方法,发现这3种方法测定的原生质体制备率的变化趋势及大部分数值是基本一致的,其中,流式细胞仪绝对计数法和细胞壁染色绝对计数法,用流式细胞仪代替了传统的显微镜下人工计数,在加快实验速度、节省人力的同时,也提高了实验数据的客观性,但细胞壁染色绝对计数法的染色操作较为复杂,对流式细胞仪激光器的要求也较高。综合考虑结果表明,利用缺乏细胞壁的原生质体对渗透压敏感、易于破裂的特点,采用流式细胞仪绝对计数法是定量测定原生质体制备率的最佳方法,具有快速(20s以内)、准确(可以准确计数108/mL以下的细胞液)、灵敏(可以检测0.5μm以上的微粒)的优点。 4.针对影响原生质体制备率的各种条件进行了系统优化。经比较不同复合酶的组成、酶用量、酶解时间,发现最适复合酶液组成(w/v)为:纤维素酶6.66%、果胶酶6.66%、离析酶13.32%,最适酶解时间为12h。在此条件下可获得的最高原生质体制备率为21.41%。研究结果为今后葡萄藻的遗传改良提供了可靠的新方法和新材料。
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