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全细胞促葡萄糖区域选择性酯合成反应的研究

冯广莉  
【摘要】:糖酯是一种生物可降解性表面活性剂,具有广泛的临界胶团浓度和亲水-亲油平衡值,被广泛应用于食品、化妆品、制药业、洗涤业等。最近报道表明,糖酯还具有抗菌、抗肿瘤和杀虫活性,这将进一度扩大其在农业和医药业的应用。目前工业上制备糖酯一般采用化学法,存在环境不友好、选择性差、副产物多等缺点。自上个世纪末人们开始研究利用酶法合成糖酯至今,酶法显示了区域选择性高、反应条件温和、环境友好等优点,然而,其工业应用却遭遇成本高、催化剂稳定性差等诸多瓶颈问题。微生物全细胞是生物催化剂的一种,微生物在自然界广泛存在,种类繁多,且其作为酶的天然载体,可以省去酶分离纯化及固定化等步骤,从而降低生产成本。此外,全细胞可为酶提供良好的环境,有效保护酶活性。但迄今为止,采用天然微生物全细胞催化糖酯合成的研究尚未见报道。鉴于此,本论文以葡萄糖酯合成反应为模型,探讨了不同来源微生物细胞在非水介质中催化糖酯合成反应的可行性;初步研究了培养基组成对细胞催化活性的影响;对比分析了不同种类微生物细胞在有机介质中催化葡萄糖与不同链长烯醇酯反应的活性及区域选择性;探讨了有机溶剂及离子液体中反应条件对该反应的影响规律;并建立了高区域选择性葡萄糖单酯合成的最佳反应体系。 研究表明,多种来源于细菌和真菌的微生物细胞能够催化葡糖单酯合成反应,且假单胞菌属和真菌全细胞的反应活性与培养基中碳源种类显著相关,这可能是由于细胞中具有催化葡萄糖酯合成反应的胞连接酶主要是诱导型脂肪酶。在含葡萄糖培养基中培养的施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri具有催化葡萄糖丙酯合成反应的最高催化活性,其催化底物转化率达96.6%。不同来源的全细胞催化剂对于底物酰化试剂链长具有不同的选择性。例如,当酰化试剂为月桂酸乙烯酯时,在含有大豆油培养基中培养的曲霉Aspergillus oryzae2具有较高的反应活性,所催化底物转化率为50.5%。 在有机溶剂中,冻干施氏假单胞菌全细胞促葡萄糖丙酯合成反应表现出一定的溶剂依赖性。在所研究的纯溶剂和混合有机溶剂中,除乙腈-吡啶和四氢呋喃-吡啶外,随着反应介质疏水性的增强,底物转化率和反应初速度增大;该细胞在异辛烷-吡啶中达到最高的催化活性。异辛烷-吡啶体系中,施氏假单胞菌促葡萄糖丙酯合成反应的最适异辛烷含量、水含量、底物摩尔比(丙酸乙烯酯/葡萄糖)、全细胞用量和反应温度分别为30%(v/v),2%(v/v),10:1,80mg mL-1和35℃;在此最优条件下,该反应初速度和转化率达到29.7mmol/L h和97.2%(反应24h后)。扩大试验表明,施氏假单胞菌全细胞促葡萄糖酯合成反应体系具有工业化应用的潜能。 在新型离子液体反应介质中,施氏假单胞菌促葡萄糖酯合成反应亦能顺利进行。在所研究的纯离子液体中,施氏假单胞菌全细胞仅在C4MIm TfO中表现中较低的催化活性。向离子液体中添加少量的四氢呋喃或吡啶能显著地提高产物的生成率。且产物的生成率随着离子液体-吡啶混合体系中离子液体疏水性的增强而增大,在C4MIm TfO-吡啶(3:2, v/v)体系中具有最大产物生成率59.6%,此外为C8MIm BF4-吡啶(3:2, v/v)体系(产物生成率54.4%)。离子液体浓度对该反应有着明显影响,在C4MIm TfO-吡啶和C8MIm BF4-吡啶体系中最适的离子液体浓度为60%,而在C4MIm TfO-四氢呋喃体系中最适的离子液体浓度为20%。在C4MIm TfO-吡啶(3:2,v/v)中,除葡萄糖与硬脂酸乙烯酯之间的反应外,全细胞促葡萄糖酯合成反应随着酰基供体碳链长度的增大,产物生成率降低,反应达到平衡所需的时间也延长。在0-168h内,葡萄糖与月桂酸乙烯酯、肉豆蔻酸乙烯酯、棕榈酸乙烯酯或硬脂酸乙烯酯的最大产物生成率分别为90.9%、79.5%、41.0%和60.7%。此外,含离子液体体系中微生物细胞的操作稳定性研究表明,离子液体的加入能大大地提高施氏假单胞菌细胞的稳定性;在C4MIm TfO-吡啶和C8MIm BF4-吡啶体系中全细胞使用一次后的相对活性分别为51.6%和38.2%,远高于在纯吡啶中的相应值。 HPLC、UHR-TOF-MS、13C-NMR等分析表明,在本研究范围内,可催化葡萄糖转酯反应的全细胞在有机溶剂或离子液体中,均对葡萄糖具有较高的区域选择性;在以丙酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、肉豆蔻酸乙烯酯、棕榈酸乙烯酯或硬脂酸乙烯酯为酰基供体的合成反应中以催化葡萄糖的6′-羟基为主,选择性大于99%。


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