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《华南理工大学》 2015年
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基于非变性微型2DE-网格凝胶切取—定量LC-MS/MS蛋白质相互作用组学方法的建立及人类血浆蛋白质的分析

步淑杰  
【摘要】:蛋白质之间相互作用的研究对于理解蛋白质的功能及细胞过程的机理至关重要,但目前常用的蛋白组学策略在蛋白质相互作用的大规模分析上均有显著不足。本工作中,我们首次建立了基于“非变性微型凝胶二维电泳?网格凝胶切取?定量纳升级液相色谱串联质谱联用”的全新蛋白质相互作用组学策略,并成功地应用于人类血浆高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)的研究。HDL是一种具有高多态性的血浆蛋白,其成员具有不同的蛋白和脂类组成,在人血浆蛋白的非变性2DE谱图上表现为两个维度的广泛分布(p I 4.6-5.3,Mw 70-500 k Da,文献中以免疫化学染色(immunochemistry)[1]及基质辅助激光解吸电离质谱肽指纹图谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry Peptide mass fingerprinting,MALDI-MS PMF)[2]验证HDL具有两个维度的广泛分布。因此我们选择了该蛋白组作为新组学策略研究中的模型体系。具体来说,人血浆蛋白经非变性微型2DE分离,将HDL所在区域(5 mm?18 mm)均匀地切割为5列、18行,共90个1 mm?1 mm的方形胶粒,每一个胶粒中的蛋白均经胶内酶解、肽段提取、定量标准品添加等处理,所得肽段样品进行定量液相色谱串联质谱分析(LC-MS/MS,非标定量),获得所含蛋白的种类及含量信息。采用网格凝胶切取的意义在于(i)保证切取区域内的蛋白全部投入分析,克服传统的选点切取对于染色较淡区域的忽视;(ii)标准化LC-MS/MS样品处理中的诸条件;(iii)能够根据LC-MS/MS定量结果重构出非变性蛋白在凝胶上的分布。在90个方形胶粒中,共检测到154种蛋白(角蛋白已剔除),每种蛋白都有其在所有网格中的含量信息。我们编写了Excel Visual Basic(VB)宏程序绘制了相应的网格(5列?18行),并针对每种蛋白将其在各方格中的含量以不同浓淡的颜色填入,如此,重构了每种蛋白在凝胶网格切取区域的含量分布谱图,我们将其定义为非变性蛋白谱图(Native protein map),共得到154个蛋白质非变性谱图。通过对154个蛋白质非变性谱图的比较,发现载脂蛋白A-I(Apolipoprotein A-I,Apo A-I)的非变性谱图与之前以免疫化学染色[1]测定的HDL分布区域相吻合,这与Apo A-I是HDL的主要蛋白成分相符。将Apo A-I与其它153种蛋白的非变性谱图相比较,发现11种蛋白的分布与Apo A-I的主要分布区域(p I 4.8-5.1,Mw 80-200 k Da)具有很高的相似性,文献查询证实这11种蛋白都有多篇文献报道为HDL的组成蛋白。对低丰度蛋白的非变性谱图的分析进一步发现有20种蛋白质分布在Apo A-I的主要分布区域,其中7种分泌蛋白(共9种分泌蛋白)有文献报道与HDL存在相互作用。本论文中所建立的方法的原创性在于首次对非变性2DE凝胶采用网格切取以利于后接定量LC-MS/MS,通过重构非变性蛋白含量谱图、谱图比较,从而分析蛋白质间相互作用。首次实现人血浆HDL成员或相关蛋白在非变性凝胶上分布的可视化,对研究高血脂等与HDL分布及代谢密切相关的疾病的致病机制和药物研发工作具有重要意义。目前,该方法已成功应用于真核细胞蛋白质组大规模相互作用预测的研究[3]。最后,我们讨论了非变性微型2DE分离的Sprague Dawley(SD)大鼠血浆蛋白(CBB染色)?所有胶点选点切取?LC-MS/MS的分析结果,该工作首次报道SD大鼠血浆蛋白在非变性2DE凝胶上的分布及种类(2-DE mapping),对于以SD大鼠为实验动物的各项研究具有参考意义。
【学位授予单位】:华南理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:Q51

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