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《华南理工大学》 2015年
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基于非变性2DE-网格凝胶切取—定量LC-MS/MS的非变性细胞蛋白质组学及规模相互作用分析策略的建立

张君  
【摘要】:在真实的细胞环境中,蛋白质通过相互作用行使其功能,对蛋白质间相互作用的研究对于理解蛋白质的结构、功能及相关的细胞过程具有极其重要的意义,是目前蛋白质组学及其相关学科研究的热点和难点。本研究选择人体支气管平滑肌细胞(human bronchial smooth muscle cells,HBSMC)水溶性蛋白质组为模型体系,以基于“非变性微型二维凝胶电泳―网格凝胶切取―定量液相色谱串联质谱”接以“非变性蛋白质谱图相似性比较分析”的全新组学策略对该体系进行了全局的鉴定、定量及相互作用分析。具体来说,全局的鉴定和定量分析分为三个部分:(A)HBSMC水溶性蛋白质组的提取和非变性微型二维凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2DE)进行分离;(B)对凝胶的全局网格切取,将2DE凝胶的主体部分(约30 mm×40 mm)系统地、无差别地划分和切割为1.1 mm×1.1 mm的凝胶方块(厚度为1.0 mm);(C)对所得的972个胶块分别进行胶内酶解,所得肽段经由纳升级超高效液相色谱串联质谱(nano ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,nano-UPLC-MS/MS)分析,再经由蛋白质组学软件处理,得到鉴定及非标记定量分析结果。结果显示:(1)单个方格中检测到的蛋白质种类的数目从2到280不等,平均约80种/方格。在成功分析的967个凝胶方格中,总共检测到了4323种蛋白质。(2)定量LC-MS/MS分析提供了每种蛋白质在每个方格中的含量。据此,可以重构每种蛋白质在凝胶上(972个方格组成)的含量分布,得到其非变性蛋白质谱图(native protein map)。直观观察发现每种蛋白质都有其特征分布,是其在非变性条件(近生理条件)下生化性质和与其它蛋白质相互作用的综合结果,但对这些信息的抽提需要建立多种评估和深度分析方法。鉴于具有稳定相互作用的蛋白质在非变性2DE过程中将以复合物形式泳动,因此应在同一区域得到检测。基于此,我们建立了通过评估蛋白质分布谱图之间相似性(similarity comparison)进而预测蛋白质间相互作用的方法。分布谱图相似性比较的核心是“重合因子”(overlap factor)的定义及其计算的程序化。对在3个及以上方格中有分布的2328个蛋白质的非变性谱图进行了两两比较(共比较近270万次,得到2328行×2328列的重合因子矩阵),当设定重合因子为0.65时,共筛选得到431个蛋白质相互作用对。经过数据库(Uni Prot KB)检索和文献确证,显示其中301个蛋白质相互作用对已有文献报道,共形成35个蛋白质复合物,并预测了一个新的蛋白质复合物在人体中的存在。这些结果充分证明此全新的非变性组学分析策略在细胞蛋白质组相互作用规模化预测上的性能。这不仅是第一次将非变性2DE凝胶上细胞蛋白质的分布可视化,也是第一次通过比较非变性蛋白质谱图相似性分析近生理条件下的蛋白质复合物。我们预计,若使用更为灵敏的质谱时,将能够预测更多低丰度蛋白质相互作用对的存在,进一步扩大该策略的应用深度和广度。在后续工作中,我们还进一步讨论和验证了水溶性蛋白质组分含有相当比例的膜蛋白质(反之亦然),提示若加强对膜蛋白质的溶解,将能进一步扩大该组学策略在细胞全蛋白质组研究中的应用。
【学位授予单位】:华南理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:Q51

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