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《华南理工大学》 2018年
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呋喃西林代谢物SEM单克隆抗体的制备及其荧光定量检测试纸条的研究

李斌  
【摘要】:呋喃西林代谢物SEM对人体有致癌、致畸胎等副作用,中国卫生部于2010年3月22日将呋喃西林药物列入可能违法添加的非食用物质黑名单。目前动物源性食品中有毒、有害物质的检测技术主要包括色谱技术和免疫分析技术。色谱技术的样本处理较繁琐费时,且需要专业分析人员操作。免疫分析技术主要有酶联免疫分析方法(ELISA检测试剂盒)和胶体金法(胶体金试纸条)。ELISA法虽然具有高灵敏和高通量的特点,但检测时间较长。胶体金法的特点就是快速(10-15分钟)和易操作,但检测灵敏度较低,比ELISA法相差5-10倍。为了建立一种快速、高灵敏度、高通量的免疫分析方法,本研究在分析SEM免疫学特性的基础上,制备了SEM抗原及其单克隆抗体,并研发了SEM荧光定量检测试纸条。主要研究成果如下:(1)呋喃西林代谢物衍生物人工抗原的合成与鉴定本研究通过有机合成手段将SEM与4-(3-醛基-4-硝基-苯氧基)-丁酸(NOCP)衍生制备了与2-NPSEM结构相似程度较高的半抗原(NOCPSEM),并通过质谱和核磁鉴定。通过活化酯法将合成的半抗原化合物分别与BSA和OVA偶联制备免疫原NOCPSEM-BSA和包被原NOCPSEM-OVA,并通过紫外扫谱法进行了鉴定。(2)抗2-NPSEM单克隆抗体的制备与鉴定用合成的人工抗原NOCPSEM-BSA免疫BALB/C小鼠,制备出了高纯度、高特异性的单克隆抗体。并通过对NOCPSEM-OVA包被原浓度和抗体浓度的优化,最终确定了抗2-NPSEM单克隆抗体的效价为2560000,IC50值为0.23ppb,与结构类似物(2-NPAMOZ、2-NPAOZ和2-NPAHD)的交叉反应率均小于0.1%。(3)荧光定量检测试纸条的研制分别对荧光微球活化体系、荧光微球的稀释倍数、测试线和质控线包被浓度、处理液类型、样品稀释液等参数进行优化,建立了检测2-NPSEM的荧光定量检测试纸条方法。研制出试纸条的灵敏度为0.2ppb;检测时间为15 min;样本添加0.5ppb时,回收率为80-136%;假阴假阳性率为0;与结构类似物的交叉反应率均小于0.1%;试纸条的批内和批间变异系数均小于5%;试纸条在50℃下加速60天,性能无变化。结果表明,本研究建立的荧光定量检测SEM残留的方法与ELISA法相比,检测时间从75min缩短为15min,且同样可实现定量检测;而与胶体金法相比,在保持同样快速的前提下,灵敏度提高了约5倍。本研究荧光定量试纸条可满足实际样品检测的需求,也为商品化SEM荧光定量检测试纸条的组装奠定了基础。
【学位授予单位】:华南理工大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:TS207.3;O657.3

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