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桑葚多糖的结构鉴定、活性评价及其体外消化酵解

陈春  
【摘要】:本论文对桑葚多糖的提取、分离纯化、结构鉴定、抗氧化及降血糖活性进行了系统的研究;同时,阐明了桑葚多糖在口腔及肠胃中的消化特点和在人体肠道菌群中的酵解特点;最后进一步通过肥胖型糖尿病模型鼠探讨多糖对小鼠高血糖症状及肠道菌群的影响,对于提高桑葚的利用率提供了理论基础,主要结论如下:(1)本研究利用响应面分析方法对桑葚多糖超声提取各项参数进行了优化,在优条件下(液固比40.25 mL/g,提取温度69℃,超声功率190 W,提取时间75 min),桑葚粗多糖(MFP)的提取率为3.13 ±0.07%,与理论预测值3.04%基本一致,证明利用响应面分析法对桑葚多糖超声提取条件的优化准确有效。此外,对粗多糖MFP进行脱蛋白处理得到多糖MFP1,进一步脱色处理得到多糖MFP2。三种多糖MFP、MFP1及MFP2中蛋白质含量分别为16.50±0.86%、1.57±0.63%及1.02±0.18%,多糖含量分别为58.61 ± 1.47%、69.98 ± 0.91%及81.18 ± 1.29%。体外抗氧化活性表明MFP1的抗氧化活性要优于MFP及MFP2;而粗多糖MFP2具有较强的体外降血糖活性,这可能与其中的化学组成或物理性能有关。(2)对于水提得到的桑葚多糖进行脱色脱蛋白,得到桑葚多糖(MFPs),采用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱对MFPs进行分离纯化,得到MFP-1、MFP-2、MFP-3 及 MFP-4 四个多糖组分,分别占 MFP 的 2.74%、4.26%、15.2%和 29.4%;多糖含量分别为 88.4 ±1.34%、75.7 ±2.67%、86.3 ±0.57%及 81.3 ±1.10%;蛋白质含量分别为 3.54 ±0.89%、6.31 ±0.57%、5.74 ±1.40%及 4.11 ±0.97%。红外光谱表明四种桑葚多糖组分都具有多糖特征吸收峰;刚果红实验表明四种多糖组分均不具三股螺旋构象;扫描电镜显示MFP-1及MFP-3表面光滑致密但不平整,MFP-2表面光滑,但有很多孔洞,MFP-4表明光滑致密,呈纤维絮状。此外,MFP-3及MFP-4均具有较强的抗氧化能力及抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的作用。(3)通过葡聚糖凝胶层析柱对MFP-3进行进一步分离纯化,得到均一多糖MFP3P,多糖含量为94.2%,分子量为136.6 kDa,主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖以及半乳糖醛酸组成,其对应的摩尔比分别为25.98%、21.51%、23.1%、13.06%及16.35%。构成糖链的单糖残基类型主要包括(1 → 6)-linked α-D-Glc、(1 → 2)-linked α-L-Rha、(1→3)-linkedα-D-Gal、(1→3)-linkedβ-L-Rha 和(1→)-linkedα-L-Ara 单元。此外,以桑葚多糖MFP3P作为表面修饰剂,与硒螯合成功制备出新型多糖硒配合物MFP3P-Se,其中Se含量为452μg/g,分子量为89.1kDa。MFP3P与Se螯合之后,显著增强了其抗氧化活性,对胰岛RIN-m5F细胞增殖以及胰岛素分泌的促进作用也得到了提高。(4)通过体外模拟人体口腔-胃-肠消化系统,研究桑葚多糖MFPs的消化过程,结果发现桑葚多糖在唾液中,分子量分布为128.7 ±6.1 kDa、13.6 ± 1.4 kDa及2.9 ±0.1 kDa,没有改变;经胃液消化后,其分子量降低为84.3 ± 4.7 kDa、5.2 ± 0.1 kDa及1.2 ± 0.1 kDa;经肠液消化后,其分子量有一定程度的降低,但不显著。同时,在经肠胃消化过程中,还原糖的含量由0.051 ± 0.003 mM增加到0.451 ± 0.011 mM,未检测到游离单糖,表明桑葚多糖经肠胃降解主要是糖苷键的断裂,未产生游离单糖。此外,将桑葚多糖MFPs与油脂混合制备乳液,其表面张力为0.132 ±0.002 Pa.s,粒径为74.7 ±0.18 μm;且在体外模拟消化的过程中,桑葚多糖MFPs能够显著抑制油脂的降解。(5)研究桑葚多糖MFPs体外酵解及其碳水化合物对酵解的作用。桑葚多糖MFPs在人体粪便培养物中酵解48 h后,培养物中总短链脂肪酸(SCFA)、乙酸、丙酸和丁酸的含量逐渐增加,导致pH由7.12降为6.14。多糖中45.36 ± 1.36%的碳水化合物被消耗,其中阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖以及半乳糖醛酸的消耗量分别为35.72 ±1.51、23.1 ±1.19、41.43 ±1.52、26.36 ±1.93 和 65.57 ±1.07%。其中,乙酸和丁酸含量的增加主要是由于多糖中半乳糖和半乳糖醛酸的酵解,丙酸含量的增加主要是由于阿拉伯糖和葡萄糖的酵解。在酵解6 h后,多糖MFPs会引起酵解培养物中菌群多样性的变化,主要是拟杆菌门(Bacteroidetes)含量增加以及厚壁菌门(Firmicutes)含量减少。(6)以肥胖型糖尿病db/db小鼠为模型,研究发现当剂量为500mg/kg/day和800 mg/kg/day时,桑葚多糖MFPs对小鼠糖尿病病情有良好的改善作用,主要表现在:(a)降低饮食量和饮水量,控制体重增长,降低空腹血糖浓度,提高糖耐量;(b)降低糖尿病小鼠血清游离脂肪酸、胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平,同时提高高密度脂蛋白水平;(c)对肝脏、肾脏和胰腺组织有积极的保护作用;(d)糖尿病小鼠肝脏中的过氧化氢酶、超氧化物歧化酶及谷胱甘肽过氧化物酶的活性明显提高,且丙二醛含量降低,体内抗氧化系统得到增强。此外,桑葚多糖MFPs对糖尿小鼠肠道菌群组成结构产生显著性改变,拟杆菌门(Bacteroidetes)比例显著增加,厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)比例显著降低,增加了菌群组成的丰富度和多样性,有利于小鼠肠道健康。


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