转基因鱼腥藻7120生长与外源基因表达的优化控制

【摘要】：α型肿瘤坏死因子(TNF—α)具有多种生物学活性，随着研究的深入，其低毒高效的的抗肿瘤作用已成为可能，在临床上具有广阔的应用前景，目前重组TNF及其衍生物的研究发展迅速。前人已成功将hTNF—α基因转入鱼腥藻7120并得到表达，为了提高细胞培养密度和外源基因表达水平，本文研究了基因工程藻的质粒稳定性及其混合营养型培养，并在反应器中研究了转基因鱼腥藻7120培养和产物TNF—α的表达，为产业化打下基础。 首先研究转基因鱼腥藻生物量与吸光度的关系，得到分光光度法测定生物量的波长、测定范围和标准曲线。 转基因鱼腥藻7120与野生藻生长速率很接近。影印法证实转基因鱼腥藻7120能保持质粒分配稳定性。比较无选择压力下连续传代的转基因鱼腥藻7120在不同培养基中的生长和外源基因表达，证实没有发生质粒部分缺失，但转基因鱼腥藻在无选择压力下会降低重组质粒拷贝数。在培养过程中，种子培养基含有的新霉素可以保持生产过程质粒稳定，这可以大大减少新霉素用量。 转基因鱼腥藻7120能以混合营养方式生长，并能有效提高生长速率和外源基因表达水平，培养条件对转基因鱼腥藻7120的生长和外源基因表达有很大影响。研究发现采用含蔗糖9g／L和NaNO_32.25g／L的BG-11培养基，接种量大于5％，光强1000Lux，光暗周期为12hr／12hr，温度25～30℃，100mL摇瓶装液量30mL，最适于转基因藻7120的生长和外源基因表达，而培养基初始pH值影响不大。在最适培养条件下，转基因鱼腥藻15天生物量可达到3g／L以上，可溶性蛋白含量接近0.3g／g藻干重，TNF—α表达水平大于22％，与自养时相比，生物量增加82.06％，表达水平提高38.79％。培养过程碳氮源利用率低，转基因鱼腥藻在最初6天外源基因表达水平稍低，然后在9～15天生长正常时基本保持稳定。 流加培养对转基因鱼腥藻的生长有利。间歇流加稀盐酸控制过程pH值为8.5能促进生长而不影响外源基因表达。流加碳氮源培养证明单独流加碳源对转基因鱼腥藻7120生长与外源表达影响很小，单独流加氮源和同时流加碳氮源可明显促进生长，而且能轻微促进藻细胞的TNF表达。 藻类生长除了需要合适的营养源外，许多生长因子对生长具有较大影响。