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《华南理工大学》 2004年
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单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA疫苗的构建及免疫学性质研究

韩双艳  
【摘要】:单纯疱疹病毒Ⅱ型(Herpes Simplex Virus Ⅱ,HSV-2)主要引起生殖器粘膜感染,临床表现为生殖器疱疹(genital herpes,GH)。GH近年来发病率明显上升,成为许多国家和地区的重要性病,是我国八大性病之一。HSV-2初发感染后,可在中心神经系统潜伏,终生复发。HSV-2易经性接触传播,可形成亚临床感染、潜伏感染、复发感染,目前尚无特效药物控制其发生和复发。接种疫苗是预防和治疗HSV-2感染最有希望的方法之一。DNA疫苗可激发全面的免疫应答,是研制抗HSV-2感染疫苗的主要方向。 本研究从临床分离的野生株中克隆保护性抗原编码基因gD2(Arg92-Ala302),构建重组真核表达质粒pVAX-gD。研究pVAX-gD在体外的表达,评价其激发动物产生免疫反应的能力及对动物的保护作用。 首先采用组织培养、透射电镜观察,分离鉴定一株造成严重复发的单纯疱疹病毒Ⅱ型野生株。根据Gene Bank提供的HSV-2糖蛋白D基因(gD2)序列设计PCR引物,特异性扩增野生株gD2全长片段,将其克隆于pUCm-T载体中。gD2基因的测序结果表明:与Gene Bank提供的HSV-1 gD DNA碱基同源性达84.6%,氨基酸同源性达82.7%;与HSV-2 gD DNA碱基同源性达98.4%,氨基酸同源性达95.7%。 BIMAS、SYFPEITHI软件分析gD2全长氨基酸序列,表明:MHC Ⅰ、Ⅱ类分子识别的抗原表位集中于野生株gD2的Arg92-Ala302之间。PCR扩增获得gD2(Arg92-Ala302)基因片段,将其与真核表达载体pVAX1在体外重组。经单双酶切鉴定,获得重组真核表达质粒pVAX-gD。 将重组真核表达质粒pVAX-gD转染哺乳动物细胞COS-7,RT-PCR检测到gD2的mRNA表达。SDS-PAGE电泳显示,pVAX-gD转染的COS-7细胞裂解液中出现一条分子量约23kD的蛋白条带,与gD2(Arg92-Ala302)理论分子量一致。免疫印迹实验表明该蛋白条带可被gD2单克隆抗体特异识别。细胞免疫组化证实gD2蛋白在细胞胞浆表达。 重组真核表达质粒pVAX-gD肌注免疫豚鼠,发现:pVAX-gD组豚鼠血清的中和指数远远大于同期pVAX组和NS组。pVAX-gD可诱导豚鼠产生高滴度gD2IgG,维持近三个月。外源特异性抗原再刺激时,迅速发生再次免疫应答。MTT法检测脾淋巴细胞增殖显示pVAX-gD具有一定的刺激脾淋巴细胞增殖能力。抗病毒攻击实验表明pVAX-gD能有效地保护豚鼠抵抗HSV-2病毒感染,延缓初发感染,减少复发,具有明显的免疫保护作用。
【学位授予单位】:华南理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R392

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1 韩双艳;单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA疫苗的构建及免疫学性质研究[D];华南理工大学;2004年
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