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可控酶解从海洋鱼蛋白中制备生物活性肽的研究

林伟锋  
【摘要】:本文主要以沙丁鱼蛋白为原料,利用可控酶解技术、超滤和离子交换法分离手段,研究制备生物活性肽的方法,并进行抗疲劳活性研究。 在可控酶解工艺优化的研究中,主要研究了pH值、水解时间、蛋白酶的种类和用量、底物的初始浓度和种类、水解温度以及搅拌方式对水解效果和酶解物的分子量分布的影响,实验结果如下: 基于水解体系的pH值变化对其酶解物的分子量分布和肽提取率的高低影响很小,确定水解过程中不必加碱保持体系pH值的恒定。水解过程可分为三个阶段,分别是快速上升阶段、缓慢增长阶段和平衡阶段,可作用底物浓度下降是导致水解过程产生这三个阶段的主要原因;随着水解时间的延长,酶解物的平均肽链长度下降,表明了大分子量肽组分含量降低,低分子量肽含量升高。四种蛋白酶中以胰蛋白酶的水解效果最好,其次是碱性蛋白酶和复合蛋白酶,中性蛋白酶的水解效果最差;四种蛋白酶使用量均以2000U/g~3000U/g的范围比较合适。底物初始浓度过高,将降低水解反应速度,胰蛋白酶水解沙丁鱼蛋白的底物初始浓度以7.5%比较合适;沙丁鱼蛋白的水解效果优于红三鱼蛋白。胰蛋白酶和碱性蛋白酶的最佳水解温度应是55℃左右,而复合蛋白酶、中性蛋白酶的最佳水解温度则为50℃左右,而鱼自溶酶最佳水解温度则为45℃。连续搅拌的水解效果更佳。起始底物浓度、酶的种类和底物的种类等因素明显影响氮提取率和肽提取率与水解度之间关系。 通过数学推导及实验分析,得出可控酶解动力学模型及其相关参数,分别为:DH=9.8041n[1+(1.701E_0/S_0-0.00367)t]和R=(16.678E_0-0.036S_0)exp[-0.102(DH)],动力学常数k_2=16.678min~(-1)和k_d=1.7015min~(-1),最低临界初始蛋白酶浓度E_0=c_0S_0,最大临界底物初始浓度S_0=E_0/c_0,c_0=2.159×10~(-3)。 超滤分离方法的研究表明,酶解液的PCL和平均分子量减小,将提高平均透过速率、膜效能和组分的透过率,降低组分的截留率;证实了分离膜对水解液中不同分子量组分具有分离的作用,通过二级超滤处理,酶解液可被具有不同截留分子量的分离膜分离成三部分。 离子交换法的研究表明,较低离子强度的初始缓冲液、合适的上样量及恰当离子强度的洗脱剂有利于提高交换容量和分离效果;两浓度两步洗脱法有利于提高分离效果,减少洗脱剂的用量;在中性条件下,中性蛋白酶酶解液中的中性肽和带正电荷的肽的含量最高,而胰蛋白酶则最低。实验结果表明,离子交换法能有效地实现酶解液中肽组分的分离。 动物实验证明,活性肽能显著延长小白鼠的游泳时间,活性肽的剂量与小白


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