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《华南理工大学》 2003年
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无花果沙雷氏菌壳聚糖酶的生化性质及产酶条件的研究

段杉  
【摘要】:通过实验建立了筛选壳聚糖酶产生菌的模型,在培养基中以壳聚糖为唯一碳源,培养基的PH6.0,通过观察培养基上透明圈的方法对菌株进行选择。采用这种方法对各地27个土壤样品进行筛选,获得一株细菌,该菌可分泌活力较高的壳聚糖酶。经鉴定为无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria),命名为CH-0203,该菌可以产生壳聚糖酶为本研究首发现。该菌株所产壳聚糖酶为胞外酶,以壳聚糖和葡萄糖胺为碳源都能有效诱导产生壳聚糖酶,而壳聚糖的诱导效果要好于葡萄糖胺,其他碳源效果不好。 该菌株产壳聚糖酶的最适发酵条件为:培养基中以0.5%高脱乙酰度的壳聚糖为唯一碳源和氮源,无机盐组成为:KH_2PO_4 0.10%;Na_2HPO_4·12H_2O 0.05%;MgSO_4·7H_2O 0.05%;CaCl_2 0.001%;KCl 0.15%;Na_2SO_4 0.15%,培养基PH6.5,发酵温度30℃,添加0.05%的吐温80,装液量为40ml(采用250ml的三角瓶时),接种龄和接种量分别为发酵24小时的种子液和2.0ml(采用250ml的三角瓶时)。在此条件下,无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)CH-0203发酵液的酶活可达到5.4U/ml。 CH-0203菌的发酵液经硫酸铵分级沉淀,发现壳聚糖酶主要存在于60~90%饱和度的沉淀部分中。对经硫酸铵分级沉淀获得的粗酶进一步分离纯化,依次经过Superdex75凝胶柱层析和羧甲基纤维素离子交换柱层析获得纯酶。共纯化了6.22倍,其比酶活为69.7U/mg,回收率为23.5%,经SDS-PAGE电泳检测,证明该酶已达均一。 该酶分子量为29Kdal;等电点为9.4;是一种内切酶;最适温度为45℃;最适PH值为3.6;米氏常数为0.44mg/ml;在温度低于45℃及在PH4.0~7.5之间该酶稳定;该酶可被Mn~(2+)和Co~(2+)激活,被Pb~(2+)、Cu~(2+)、Ni~(2+)、Cr~(3+)抑制;该酶以100%脱乙酰度的壳聚糖为底物时,其最终水解产物为单糖、二糖和三糖,其最适底物是脱乙酰度在85%左右的壳聚糖,脱乙酰度低于45%的壳聚糖则不能被该酶作用,对结构与壳聚糖相似的羧甲基甲壳素和羧甲基纤维素也不能作用。 通过比较多种固定化方法和载体,发现用多孔玻璃作载体吸附固定化CH0203细胞效果最好。用多孔玻璃固定的细胞发酵产酶,其最佳发酵条件是:PH6.5,培养基与载体的总体积48ml(在250ml三角瓶中),载体与培养基的比例为1.5g/4.0ml,吸附时间是20~26小时。以此条件发酵产酶,发酵液的最高酶活达到4.5U/ml。采用半连续发酵的方式,用多孔玻璃固定化的细胞可以稳定发酵产酶120小时左右,在同样培养条件下,固定化细胞发酵液酶活比游离细胞发
【学位授予单位】:华南理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:TQ920.1

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