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《华南理工大学》 2001年
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纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌与毕赤酵母中的表达

黄志立  
【摘要】:纳豆激酶(Nattokinase)是从日本传统食品纳豆中提取出来的一种具有溶血栓作用的酶。1987年由日本的须见洋行等首先发现。比之目前常用的治疗心脑血管栓塞疾病的药品如链激酶、尿激酶、重组组织型纤溶酶原激活剂、对-甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶激活剂复合物和尿激酶原等,纳豆激酶具有安全性好、易被人体吸收、作用直接迅速、作用持续时间长、造价低廉等优点,可作为一种很有前景的新型药物予以开发。本研究利用基因重组技术,将纳豆激酶基因分别在大肠杆菌与毕赤酵母中实现了表达,得出如下结果: 首先根据已知的纳豆激酶基因序列及原核表达载体pBV220的性质,设计引物,通过对PCR反应条件的优化,得到PCR扩增纳豆激酶基因的优化条件为:染色体基因组10ng左右,Mg~(2+)浓度1.5mmol/L,退火温度60℃。反应时间参数为:95℃热启动变性3min,然后进入循环:94℃,1min,60℃,1min,72℃,3min,30个循环结束后,72℃,15min。在这种优化程序下进行PCR反应,获得了特异、高效和忠实的纳豆激酶基因产物。 成功地构建了pUC19-T载体,并克隆到PCR产物,克隆产物经过单酶切、双酶切、PCR分析及序列测定,证明克隆到pUC19-T载体上的外源基因的即为纳豆激酶基因。 将重组质粒pUC19-NK上的纳豆激酶基因成功克隆到表达载体pBV220上,并将之转入大肠杆菌HB101中,得到转纳豆激酶基因工程菌,提取重组质粒经单酶切、双酶切及PCR分析验证后,对重组菌的生长及表达进行一系列研究,结果表明:外源纳豆激酶基因的导入对宿主的生长没有明显的影响:重组质粒的稳定性实验表明:该质粒具有良好的分离稳定性,而结构稳定性较差。表达动态研究表明:转基因工程菌在30℃培养6h后,在42℃诱导5h,外源基因可以获得较高的表达,发酵上清液中酶的表达量相当于120U/mL菌液。SDS-PAGE分析结果表明:该酶基因的表达产物可以分泌到细胞外,胞外酶表达量占菌体蛋白的12%左右。 为了进一步提高外源基因的稳定性及表达量,将纳豆激酶基因克隆到毕赤酵母中进行研究。根据已知的纳豆激酶基因序列及载体pPICZαA的性质设计PCR反应的引物,通过适当调整PCR反应的退火温度,以纳豆杆菌染色体组DNA
【学位授予单位】:华南理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:TS201.3

【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 郭妍妍;纤溶酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达[D];河北农业大学;2011年
【参考文献】
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【同被引文献】
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