金线鱼胃蛋白酶纯化鉴定及结构研究

【摘要】： 金线鱼在南海区以北北部湾、珠江口至海陵岛近海区产量较多,是底拖网作业的主要捕捞对象之一,也是刺网和钓业的重要捕捞鱼种,是广东省的主要的海产经济鱼种。本文采用酶学、复性电泳技术和分子生物学的研究技术,对金线鱼消化道蛋白酶分布、特性和胃蛋白酶活性变化规律进行了系统研究;对金线鱼胃蛋白酶在碱变性、抑制作用和Cu2+激活过程中的动力学性质的影响、光(色)谱变化、作用机理及金线鱼胃蛋白酶对动物蛋白和植物蛋白的水解作用机理做了初步探讨。 对3组不同体重的金线鱼(Nemipterus virgatus)消化道蛋白酶的分布与特性的研究表明:金线鱼各消化器官蛋白酶活性均随实验鱼体重增加而上升,但与体重增加不成比例。不同体重的金线鱼的消化道蛋白酶不仅存在活力差异,在种类和数量上也存在明显差别。3组鱼的消化道蛋白酶单位酶活力从高到低依次为幽门盲囊胃前肠中肠后肠肝胰脏,但以总活力计算时,仍以胃部蛋白酶的总活力最大。 通过单因素试验和响应面分析,金线鱼胃部蛋白酶提取的参数条件为:提取时间为6小时,提取温度为23℃,pH 5,酶活力为1881U/g·min。金线鱼胃部蛋白酶经过硫酸铵沉淀分级、DEAE- Sepharose F. F阴离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析后,纯化得到电泳纯级的胃部蛋白酶,比活从17.4U/mg提高到184.4U/mg,纯化倍数达到10.6,收率为14.1%。分离的活性组分经SDS-PAGE凝胶电泳检测为单一蛋白活性组分,其分子量为36600Da。 金线鱼胃蛋白酶最适pH值为2.5,在pH 1.0-3.0及pH 4.0-6.0的pH范围内,较稳定;最适温度为40℃,低于40℃时较稳定,温度升高,稳定性变弱。最适底物浓度为2.0%(酪蛋白)。高浓度的NaCl抑制蛋白酶的活力。Cu2+、Mn2+和Ca2+对金线鱼胃蛋白酶有明显的激活作用。胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)、β-巯基乙醇(2-ME)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、溴乙酸(AcBr)的抑制作用结果表明分离纯化得到的金线鱼胃部蛋白酶属于胃蛋白酶,同时其活性中心含有色氨酸和组氨酸残基。金线鱼胃蛋白酶的动力学常数为:Km = 0.0684mmol/L,kcat= 101S-1,kcat / Km=1485mmol-1·S-1·L(以酪蛋白为底物)。 红外光谱、内源荧光光谱和圆二色谱分析表明,金线鱼胃蛋白酶在碱性条件下发生的变性作用保持到二级结构。胃蛋白酶抑制剂和Cu2+的作用则可引起键的断裂和再生成,使一级结构发生变化。碱变性和胃蛋白酶抑制剂的作用,使α-螺旋和β-折叠的含量不断减少,而无规则卷曲所占比例是增加的。综合各种分析结果,金线鱼胃蛋白酶的二级结构是属于高β-折叠结构的。 通过DSC和SDS-PAGE分析结果表明,天然大豆球蛋白的A亚基比B亚基更易为金线鱼胃蛋白酶降解。β-伴大豆球蛋白中金线鱼胃蛋白酶的消化顺序为:α-亚基、α′-亚基、β-亚基。热处理后,7S球蛋白的α-、α′-、β-亚基都被金线鱼胃蛋白酶消化。同时,热变性有利于游离氨基酸、小分子量肽的释放和可溶性氮的回收,能提高大豆蛋白酶解产物中肽含量,因此通过金线鱼胃蛋白酶选择性地对大豆蛋白各亚基进行水解,可以获得具有不同功能特性的肽产品。 对比研究金线鱼胃蛋白酶和其他来源胃蛋白酶水解食物蛋白的特性差异。水解肌原纤维蛋白时,金线鱼胃蛋白酶和猪胃蛋白酶在水解度上差别不大,鱼胃蛋白酶酶解产物的苦味稍低,游离氨基酸略高,可溶性氮的释放速度稍高;在水解大豆分离蛋白时,鱼类胃蛋白酶在水解度、可溶性氮的释放速度、游离氨基酸含量都高于猪胃蛋蛋白酶,苦味值略低,充分展现了在生产低苦味调味品中广阔的的应用前景。