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多重荧光PCR与液相芯片高通量病原体检测体系的建立与应用

肖性龙  
【摘要】: 多重荧光PCR与液相芯片技术具有高通量、高灵敏度等特点,可缩短检测周期、减少成本和提高效率,已成为病原体临床诊断和食品安全等领域的研究热点。本文以多重荧光RT-PCR检测病毒和液相芯片检测食源性致病菌为主线,研究关键技术环节,建立了较完整的高通量检测体系并加以应用。 研究了以磁珠为介质的病毒总核酸提取方法。具有更高的得率与纯度,适合仪器自动化提取。试剂配方为:裂解液(4.5mol/L异硫氰酸胍,50 mmol/L Tris-HCl,10 % Triton-100,20 mmol/L EDTA,pH6.0);洗液1(4.5mol/L异硫氰酸胍,46 mmol/L Tris-HCl,pH 6.0),使用时先加入40%体积无水乙醇;洗液2(75%乙醇);洗液3(无水乙醇);磁珠(Promega)。 研究了通用型多重荧光PCR反应体系,有效解决了多重PCR反应时面临的常见问题。DNA类体系缓冲液配方为:60 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3), 15 mmol/L KCl, 8 mmol/L ( NH4) 2SO4, 4 mmol/L MgCl2, 1.25 mmol/L dNTP,0.5μL DMSO。RNA类体系缓冲液配方为:60 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3),10 mmol/L KCl, 16 mmol/L ( NH4) 2SO4, 5 mmol/L MgCl2, 1. 5 mmol/L dNTP,1.0 mmol/L Betaine,0.5μL DMSO,0.5μL1mg/mL gp32。两个体系在反应时均加入与Taq酶等量的Taq抗体。 研究了含组氨酸标签的假病毒监控内标和阳性对照的制备方法,为病毒检测提供了一种更稳定,更方便的全程监控技术。通过基因工程手段将6个组氨酸插入MS2噬菌体包膜蛋白的β-发夹环结构中,构建成功带组氨酸纯化标签假病毒的通用表达载体。外源基因序列插入载体后,经诱导表达与镍离子亲和层析纯化后,可获得高浓度,高纯度的假病毒。在4℃和-20℃条件下,可用SM缓冲液稳定保存1年以上。 分别建立了多重荧光RT-PCR在猪繁殖与呼吸障碍综合症、急性出血性结膜炎与手足口病上的检测体系。各方案在选定的类似病毒范围内,特异性为100%;组内和组间的变异系数均小于2.2%;检测灵敏度高于现有方法;对疑似临床样本进行检测,检测结果与细胞分离鉴定技术或PCR测序结果相符,显示了良好的适用性。手足口病样本中含有PCR抑制因子的概率为1.8-3.4%,假阴性的出现提示了对PCR进行监控的必要性。 研制了能同时富集沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的一步法选择性培养基。其配方为(1L):胰蛋白胨17g/L、蛋白胨3g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、葡萄糖2.5g/L、丙酮酸钠2.5g/L、甘露醇5g/L、氯化钠15g/L、氯化锂2g/L、亚碲酸钾0.1mg/L、萘啶酮酸10mg/L。该培养基具有较好的选择性,能使目标菌以相对一致的速度生长,经24h培养后,菌体浓度可达到107CFU/mL以上。 研制了能同时富集沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的一步法选择性共增菌培养基。其配方为(1L):BPW培养基的基础上,加入:葡萄糖1.25g、甘露醇1.25g、无水亚硫酸钠1.25g、丙酮酸钠0.05g,氯化钠20g、亚碲酸钾1.0mg和3号胆盐2.5g。该培养基能有效地抑制大部分竞争菌群,经过一步增菌即可富集沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌达到检测限以上。 建立了肉类及水产品类常见致病菌流式液相芯片检测体系。在选定的类似病菌范围内,特异性为100%;灵敏度可达100CFU/mL,与荧光PCR技术相当。重复性实验表明,各菌检测变异系数在2%以内。研究得出影响检测信号的三个重要因素:1)目标菌扩增片断长度为100bp左右。2)上游引物也标记生物素,可增加检测信号强度65%以上。3)杂交温度的选择对检测信号也有重要的影响。


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