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《华南理工大学》 2010年
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食源微生物耐药基因水平传播抑制研究

鲁玉侠  
【摘要】: 在食用动物中使用抗生素会导致耐药菌的出现,动物感染的耐药菌可以通过直接接触、食物链和环境污染将其耐药性及耐药基因传播给人类,这直接威胁人类生命健康。本论文通过建立体外和体内小鼠肠道中耐药基因水平传播模型,在基因水平上探讨耐药菌的来源、传播途径和第一类整合子整合酶(IntI1)介导的食源性耐药基因在体外和体内小鼠肠道中的水平传播效率及小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)对其抑制作用,提出一种将siRNA用于控制IntI1介导的耐药基因水平传播及评价其抑制效果的方法。论文主要内容有以下四个部分: (1)IntI1介导的耐药基因体外水平传播 采用含有完整第一类整合子的受体质粒R388和分别含有dfrA1-aadA1、aadA1、aadB和cmlA耐药基因的供体质粒pGC-1~4,分别转化到BL21(DE3)和DH5α中形成供体菌和受体菌。无抗生素选择压力下,受体菌和供体菌进行接合实验,抗生素平板筛选,以intI1-F和系列基因盒引物进行PCR验证,最后测序验证重组位点。IntI1介导下,R388与pGC-1~4的重组效率分别为:4.6×10-3、6.8×10-4、8.7×10-5和9.9×10-5 cfu/(供体菌)。pGC-1中dfrA1-aadA1两个串联基因盒,以dfrA1和aadA1形式分别被IntI1整合。测序后比对发现,体外重组反应都发生在attI1和attC之间且IntI1介导耐药基因盒同源重组位点是attI1位点simple site中的G和TT之间。 (2)IntI1介导的耐药基因在小鼠肠道的传播 筛选肠道中不含干扰本实验的耐药菌的小鼠为模型。先灌胃0.5mL供体菌(109 cfu/mL),待供体菌在小鼠肠道中定殖水平达到108 cfu/(g粪便)时,再灌胃0.5mL受体菌(109 cfu/mL)。在第一周内隔天、之后每周取小鼠新鲜粪便样本,生理盐水悬浮,涂抗生素平板,菌落PCR验证,测序比对。结果显示:灌胃受体菌1天后,含有R388的供体菌与含有pGC-1~4的受体菌的重组效率分别为:4.6×10-2、8.1×10-3、2.2×10-4和7.2×10-3 cfu/(供体菌), pGC-1的两个基因盒dfrA1-aadA1被分别整合。与体外实验相比,体内实验显示了更高的耐药基因水平传播效率。测序发现,重组位点全部发生在attI1×attC之间。到42天时,全部整合菌株在小鼠肠道中为阴性。 (3)siRNA的设计、筛选及体外抑制耐药基因水平传播 以intI1为靶基因,设计5对特异的21bp siRNA。通过siRNA与含有R388的供体菌和含有pGC-2的受体菌共培养,考察整合效率的变化。结果显示: siRNA-1和siRNA-2对IntI1介导的整合率的抑制效率最高分别为52.1%和50.7%。siRNA干扰的最优条件为:分三次将siRNA加入共培养体系,使终浓度为0.2μmol/L,每隔2小时添加一次,共培养8h时,siRNA-1和siRNA-2处理后,对IntI1介导整合效率的抑制率分别为:60.8%和58.1%。 (4)Real-time PCR检测siRNA对整合效率和intI1 mRNA水平的影响 以一步法real-time PCR相对定量和绝对定量检测siRNA共培养前后整合效率和intI1 mRNA水平的变化。相对定量结果显示:与无siRNA相比,siRNA-1和siRNA-2处理后,整合效率分别下降了52%和55%;绝对定量结果显示:对照样品(阴性siRNA)和siRNA-1处理后样品的整合效率分别为8.1×10-4cfu/(供体菌)和3.84×10-4cfu/(供体菌),经siRNA-1处理后,intI1 mRNA水平降低了58%。表明siRNA能有效抑制IntI1介导的耐药基因水平传播。
【学位授予单位】:华南理工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:Q93

【参考文献】
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