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《华南农业大学》 2016年
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TNFα影响有机阴离子转运多肽1A2表达水平的分子机理研究

王丽雪  
【摘要】:人类有机阴离子转运多肽(Organic Anion Transporting Polypeptides,OATP)是一类重要的药物转运蛋白,能介导内、外源性物质的跨细胞转运,在药物的吸收、分布、代谢、消除方面起着重要的作用。OATP1A2为OATP家族中的一个成员,在大脑、小肠、肝脏、肾脏等不同组织中表达,可转运各种不同的药物,影响药物在细胞中的累积。因此,对OATP1A2表达水平的调控会影响机体对药物的生物利用度。炎症状态下众多药物代谢酶及转运体的表达和功能发生下调,从而导致机体对药物的处置过程会发生显著改变。研究发现,机体在该状态下会释放一系列炎症细胞因子,影响药物代谢酶的表达和功能,药物转运体也可能受到这些细胞因子的调控。已有报道表明,TNFα可导致多个OATP家族成员的表达水平下降,但是具体的分子调控机制尚不清楚。本研究通过分析OATP1A2的编码基因SLCO1A2转录起始位点前2087 bp到转录起始位点后73bp的片段,发现在转录起始位点前1834 bp到1848 bp处有一个转录因子NFκB的可能结合位点,由于TNFα对蛋白表达水平的调控往往是通过NFκB实现的,我们进一步对该位点在TNFα调控OATP1A2过程中的作用进行了系统的分析,所获得的主要研究结果如下:1.构建获得了带不同长度SLCO1A2转录起始位点上游片段的荧光素酶报告载体,发现带有NFκB结合靶位点的重组子比没有该靶位点的启动子活性低,说明NFκB的结合可能对SLCO1A2的转录表达有抑制作用;2.在对NFκB的可能结合位点进行点突变后,双荧光素酶报告基因分析发现启动子活性部分恢复,说明该结合位点在SLCO1A2表达水平调控过程中发挥了作用;3.通过TNFα对细胞进行处理,发现细胞核中NFκB的含量显著增加,表明转录因子NFκB参与了细胞对TNFα刺激的反应;4.TNFα中和抗体处理表达带有NFκB可能结合位点荧光素酶报告载体的细胞后,启动子活性部分恢复,进一步说明该位点参与了TNFα对OATP1A2的调控;5.通过染色质免疫沉淀,我们验证了该区域与NFκB的结合,并发现在TNFα存在的条件下,与该位点结合的NFκB增加,进一步揭示了TNFα对SLCO1A2表达的抑制作用是通过NFκB的负调控实现的。
【关键词】:OATP1A2 TNFα NFκB 表达调控
【学位授予单位】:华南农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q78;R91
【目录】:
  • 摘要3-4
  • Abstract4-6
  • 缩略词及英汉对照6-9
  • 1.前言9-15
  • 1.1 有机阴离子转运多肽(OATP)9-10
  • 1.1.1 概述和分类9-10
  • 1.1.2 OATP的结构10
  • 1.2 有机阴离子转运多肽 1A2(OATP1A2)10-12
  • 1.2.1 OATP1A2概述10-11
  • 1.2.2 OATP1A2对药物转运的作用11
  • 1.2.3 细胞因子对OATP表达影响的研究概述11-12
  • 1.3 TNFα 以及NFκB信号通路12-14
  • 1.4 研究目的和意义14-15
  • 2.材料与方法15-35
  • 2.1 主要仪器设备15
  • 2.2 材料15-17
  • 2.2.1 细胞株15
  • 2.2.2 菌株与表达载体15-16
  • 2.2.3 基因克隆引物16-17
  • 2.3 常用试剂17
  • 2.4 实验方法17-35
  • 2.4.1 主要溶液配方和培养基的配制17-18
  • 2.4.2 Western blot相关试剂的配制18-21
  • 2.4.3 荧光素酶报告基因表达载体的构建21-24
  • 2.4.4 定点突变24-26
  • 2.4.5 哺乳动物细胞培养26-28
  • 2.4.6 SDS-PAGE-免疫印迹28-29
  • 2.4.7 omegaPCR方法29-30
  • 2.4.8 双荧光素酶报告基因检测30-31
  • 2.4.9 染色质免疫沉淀技术31-34
  • 2.4.10 统计学分析方法34-35
  • 3.结果与分析35-47
  • 3.1 NFκB结合DNA共有序列的确定与SLCO1A2启动子中的NFκB靶位点的预测35-38
  • 3.2 双荧光素酶报告基因表达载体的构建38-41
  • 3.2.1 提取人乳腺癌细胞MCF7基因组DNA38-39
  • 3.2.2 SLCO1A2基因转录起始位点上游 2087bp和转录起始位点后 73bp片段的PCR扩增39
  • 3.2.3 双荧光素酶报告基因表达载体的构建39-41
  • 3.3 双荧光素酶报告基因表达载体的功能检测41-43
  • 3.3.1 带有不同长度片段表达载体的活性41-42
  • 3.3.2 突变体对SLCO1A2启动子活性的影响42-43
  • 3.4 TNFα 对NFκB核转位的影响43-44
  • 3.5 TNFα 中和抗体对SLCO1A2启动子活性的影响44-45
  • 3.6 NFκB与SLCO1A2基因启动子中NFκB靶位点结合的体内验证45-47
  • 3.6.1 细胞超声波破碎后染色质片段大小检测45-46
  • 3.6.2 PCR检测结合NFκB转录因子SLCO1A2启动子区NFκB靶位点的DNA片段46-47
  • 4.结论与讨论47-49
  • 4.1 结论47
  • 4.2 讨论47-49
  • 致谢49-50
  • 参考文献50-56
  • 附录56-59

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