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《华南农业大学》 2016年
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HA基因密码子优化对H5和H9亚型禽流感DNA疫苗免疫效果的影响

宋慧  
【摘要】:禽流感病毒可感染家禽、野鸟和人类,给世界家禽养殖业造成了巨大损失,同时也给人类卫生健康带来了严重的威胁,其中,H5和H9亚型的禽流感病毒影响最大。目前,疫苗接种作为控制禽流感暴发和传播的主要有效措施之一,被我国各地广泛使用。DNA疫苗作为引起第三次疫苗革命的新型疫苗,具有其他疫苗没有的大量优点,有望成为未来的消除禽流感的强有力的武器。但是,大量研究表明,DNA疫苗的低免疫原性是制约其产生良好免疫保护效果的关键因素之一,因此,本研究旨在通过将不同亚型禽流感病毒HA基因进行密码子优化提高DNA疫苗重组质粒的免疫原性,从而提高禽流感DNA疫苗的免疫效果。获取H5亚型禽流感病毒HA基因后,将该基因根据鸡密码子偏嗜性进行优化,得到优化基因opti HA5,其密码子适用指数从原来的0.78变为0.93,最优密码子使用频率从44%提升到80%,基因中GC含量由原来的40%变为优化后的54%。分别将H5亚型的禽流感病毒的HA基因和优化基因opti HA5连接至真核表达载体p CAGGK,构建了重组质粒p CAGGKHA5和p CAGGKopti HA5。将重组质粒转染至293T细胞,检测到重组质粒p CAGGKopti HA5抗原蛋白HA的表达水平明显高于p CAGGKHA5。用重组质粒免疫3周龄的SPF鸡后,在一免后2周和二免后2周,p CAGGKopti HA5免疫组的HI抗体滴度分别为3.3log2和5.0log2,明显高于p CAGGKHA5免疫组的3.2log2和4.5log2;而p CAGGKopti HA5免疫组的IFN-γ和TNF-α浓度均高于p CAGGKHA5免疫组,同时该两重组质粒组的IFN-γ和TNF-α浓度也明显高于油乳剂灭活苗。在二免后2周,以100u L106EID50的A/chicken/Guang Dong/E85/2011(H5N1)病毒攻击试验鸡后,p CAGGKopti HA5免疫组鸡无死亡,排毒率为30%,保护率为70%;p CAGGKHA5免疫组的死亡率为20%,排毒率为40%,保护率为60%。以上结果说明,DNA疫苗重组质粒在诱导宿主机体产生细胞免疫反应上比传统的油乳剂灭活苗更具优势,且HA基因优化后可以提高H5亚型禽流感DNA疫苗诱导鸡体内产生的抗体水平及IFN-γ和TNF-α水平,从而提高对鸡的免疫保护效果。获取H9亚型禽流感病毒HA基因后,将该基因根据鸡密码子偏嗜性优化后,得到优化基因opti HA9,其密码子适用指数从原来的0.79变为现在的0.94,最优密码子使用频率从48%和提升到83%,GC含量由原来的41%变为优化后的55%。分别将H9亚型的禽流感病毒的HA基因和优化基因opti HA9连接至真核表达载体p CAGGS,构建了重组质粒p CAGGHA9和p CAGGopti HA9。将重组质粒转染至293T细胞,检测到重组质粒p CAGGopti HA9抗原蛋白HA的表达水平明显高于p CAGGHA9。用重组质粒免疫3周龄的SPF鸡后,在一免后2周和二免后2周,p CAGGopti HA9免疫组的为3.8log2和4.8log2,高于p CAGGHA9免疫组的3.5log2和4.4log2,;而p CAGGopti HA9免疫组的IFN-γ和TNF-α浓度均高于p CAGGHA9免疫组,且该两重组质粒组的IFN-γ和TNF-α浓度也明显高于油乳剂灭活苗。以200u L108EID50的A/Chicken/Guangdong/G14-10/2012(H9N2)病毒攻击鸡后,p CAGGopti HA9免疫组的排毒率为40%,保护率为60%;p CAGGHA9免疫组的排毒率为50%,保护率为50%。由此说明,HA基因优化后可以提高H9亚型禽流感DNA疫苗诱导鸡体内产生的抗体水平及IFN-γ和TNF-α水平,从而提高对鸡的免疫保护效果。综上所述,根据鸡的密码子偏嗜性优化后的基因opti HA5和opti HA9与未优化HA基因相比,提高了重组质粒HA蛋白的表达效率,从而增强了DNA疫苗的免疫原性,明显提高了禽流感DNA疫苗的保护性抗体水平和细胞免疫水平,增强了其对鸡的免疫保护效果。
【学位授予单位】:华南农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S855.3

【参考文献】
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