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《华南农业大学》 2016年
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用于禽流感病毒快速检测的纳米磁珠分离器研究

刘洪山  
【摘要】:近年来,纳米技术的发展为生物学研究提供了新的手段和机遇,在生物物质的富集和分离研究中,纳米免疫磁珠分离技术显示出巨大的应用前景。纳米免疫磁珠分离技术能够有效排除分析样品中的背景干扰,实现样品的纯化和富集。其基本原理是在磁珠表面引入功能基团,将特异性抗体结合在磁珠上,使之与样品中的目标分析物发生免疫反应,形成磁珠-抗体-抗原复合物。这种复合物在外加磁场作用下做定向移动,最终被吸附并滞留在磁场中,从而将具有相应抗原表位的目标物与其它物质进行分离,达到提取、纯化和浓缩目标分析物的目的。将该技术与叉指微电极阻抗免疫传感器联用可显著提高检测系统的灵敏度并进行快速检测。本文研究的背景是禽流感病毒快速检测技术,重点研究了禽流感病毒快速检测平台中用于禽流感病毒样本采集和前处理的永磁体纳米磁珠分离器设计及相关试验。理论分析和前人研究表明:对于磁珠粒径小、材料磁化率低、流体介质粘度大的体系,免疫磁珠较难分离,要求免疫磁珠分离器应具备强磁场高梯度特征;为了实现便携,磁珠分离器的小型化也显得十分必要。在纳米磁珠分离器结构设计方面,通过分析仿真常用的永磁体磁珠分离器,提出了环形六孔纳米磁珠分离器结构,采用特制的瓦型钕铁硼永磁体同性磁极紧贴互斥以增强磁场强度的原理,用六块外磁瓦(大)和六块内磁瓦(小)磁极同性互斥摆放,磁极中间放置坡莫合金导磁片聚集和传导磁场,从而形成六个强磁场高梯度试管分离区域。磁珠分离器采用弱顺磁金属铝合金制作圆柱形外壳固定磁体,形成紧凑结构。研究中,通过改变磁珠分离器体积、导磁片材料、导磁片形状等不同设计要素设计制作了四套磁珠分离器并对各自六个分离试管孔的磁场强度和磁场梯度进行了测试分析,所设计的磁珠分离器(体积865.5cm3,重4.8kg)最高磁场强度实测1.44T,最高磁场梯度实测96.3T/m;四套磁珠分离器装置各自孔间平均相对误差均在2.0%-3.3%之间,可认为同一磁珠分离器上六个磁分离孔的分离效果相同。研究结果表明:磁珠分离器体积、导磁片材料和形状等因素对磁珠分离器磁场强度和梯度均有不同程度的影响,大体积较小体积磁珠分离器、坡莫合金较软铁导磁片、斜壁较直壁形状坡莫合金导磁片均能实现较大的磁场强度和梯度,可以根据不同应用需求,组合相关要素以获得理想的免疫磁珠分离器。在纳米磁珠分离器分离效率的研究方面,本文采用小体积的磁珠分离器(最高磁场强度1.26T;最大磁场梯度84.4T/m;体积401.3cm3;重量2.2kg)进行了磁珠分离器磁珠分离效率的定性和定量研究。在通过目测、透射电镜、Dot-ELISA验证等方法定性考核150nm免疫磁珠分离灭活禽流感病毒H5N1的基础上,采用30nm、100nm和180nm免疫磁珠分离大肠杆菌,并采用平板菌落计数法对纳米磁珠分离器的分离效率进行了定量评估,从分离时长、分离稳定性和分离灵敏度等三方面对磁珠分离器分离效率的影响开展了相关试验研究,最后在禽流感快速检测平台联合试验中采用180nm磁珠分离禽流感H5N1活病毒与荧光定量RT-PCR技术相结合的方法,定量考核了磁珠分离器对禽流感活病毒的磁珠分离效率。定性考核150nm免疫磁珠分离灭活禽流感H5N1病毒的结果表明:在1min之内,磁珠结合物在该分离器上已被彻底分离;以大肠杆菌.Ecoli O157:H7与180nm、100nm和30nm磁珠结合物为研究对象,采用平板菌落数计数方法统计的结果表明:当分离时间分别大于等于40s、60s和60min时,磁珠分离器对三种磁珠的捕获效率均在96.5%以上,且磁珠分离后的上清液中没有细菌残留;对高浓度(610 CFU/m L)和低浓度(210 CFU/m L)的大肠杆菌,180nm、100nm和30nm磁珠的捕获效率分别在96.5%~106.9%、99.7%~114.6%和98.5%~112.6%之间,对于浓度为103CFU/mL的.Ecoli O157:H7,三种免疫磁珠20个平行样品的测试相对标准偏差在0.84%~1.4%之间,说明磁珠分离器对三种磁珠分离的灵敏度和稳定性良好。在禽流感病毒快速检测平台联合试验中,定量考核180nm免疫磁珠分离禽流感H5N1活病毒的结果显示:通过注入阻抗生物芯片的阻抗变化确定的最佳磁珠分离反应时间为2min,通过荧光定量RT-PCR技术判定:在试验条件下,该磁珠分离器对102-104EID50/mL的H5N1禽流感病毒的平均捕效率为47.8%?3.2%,说明流感病毒抗体和抗原的匹配性和特异性也直接影响磁珠的分离效率。综上,磁分离器效率的研究表明:所设计的纳米磁珠分离器在微米量级的细菌和纳米量级的病毒等微生物检测中具有良好的应用前景,为禽流感检测平台的快速性建立奠定了坚实基础。
【学位授予单位】:华南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S852.65

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