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《华南农业大学》 2016年
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香蕉抗寒、抗病相关基因的遗传转化验证

窦同心  
【摘要】:香蕉(Musa spp.)是撒哈拉沙漠以南的非洲、南美、中美和亚洲4亿多人的主食,也是全世界最受欢迎的第二大水果。近年来,低温和香蕉枯萎病(Fusarium wilt)是香蕉生产上遇到的两大毁灭性灾害。通过基因工程改良香蕉的农艺性状以及增强对低温和香蕉枯萎病的抵御能力,是提高全球香蕉产量的根本途径。本研究在香蕉抗寒育种方面,根据大蕉(Musa spp.Dajiao,ABB Group)的耐寒性强于香蕉(Musa spp.Cavendish,AAA Group)的特点,在前期香蕉和大蕉比较转录组学研究的基础上,克隆出大蕉MpICE1和MpMYBS3转录因子基因,并对冷敏感香蕉进行遗传转化,研究其在香蕉耐寒性方面的功能。本研究在香蕉抗枯萎病育种方面,通过对香蕉枯萎病菌早期发育蛋白质组学和24种VCGs类型病原菌基因组的分析,从其基因组保守核心区域鉴定到了两个关键的发育调控基因FoERG6和FoERG11,并将这两个关键基因作物靶标基因,运用寄主植物诱导基因沉默技术(HIGS)对感病香蕉品种进行遗传转化,干扰香蕉枯萎病病原菌生物膜功能,成功培育出了对香蕉枯萎病有一定广谱耐性的香蕉新种质,从理论到实践地验证了HIGS在香蕉抗枯萎病应用的可行性和有效性。最后,为了建立特异清除植物果实中外源基因的技术,本研究以拟南芥花原基细胞决定基因LEAFY的启动子LFY建立了驱动重组酶凡FLP基因的特异基因清除载体pBIN19-LFY-FLP,并通过农杆菌介导的方法将“Gene-Deletor”载体导入拟南芥,然后对转基因株系的外源基因清除情况进行了分析,检验了花原基细胞决定基因启动子LFY在拟南芥中的清除效果,最后将“Gene-Deletor”载体对香蕉进行遗传转化,为香蕉的生物安全性研究提供基础。其主要研究结论如下:1.MpICE1和MpMYBS3转录因子基因特征及生物信息学分析本研究从大蕉中克隆到两个抗寒相关转录因子,命名为MpICE1(Genbank登陆号:KM379133)和MpMYBS3(Genbank登陆号:KM379134),并进行了生物学功能预测和分析。MpICE1位于香蕉基因组十号染色体上,其ORF为1680 bp,编码一个由559个氨基酸组成的蛋白质,推测分子量为59 kD,pI=5.09,氨基酸结构和系统进化树分析证明MpICE1含有保守的bHLH保守结构域和ACT-like等结构域,属于拟南芥ICE1同系物,亚细胞定位表明,MpICE1在水稻原生质体中定位于细胞核。MpMYBS3位于香蕉基因组二号染色体上,其ORF为981 bp,编码一个由326个氨基酸组成的蛋白质,推测分子量为35.59 kD,pI=9.17,氨基酸结构和系统进化树分析证明MpMYBS3含有保守的1R等结构域,与水稻MYBS3具有较近的亲缘关系,其亚细胞定位也定位于水稻原生质体细胞核中。2.超表达MpICE1和MpMYBS3提高香蕉的耐寒性对异源超表达MpICE1和MpMYBS3的转基因香蕉进行分子检测和耐寒性测试,结果发现,随着冷胁迫时间的延长,转基因香蕉植株叶片中脯氨酸含量高于野生对照,而电导率、丙二醛含量则显著低于野生型,这可能使超表达MpICE1和MpMYBS3的香蕉植株耐寒性明显得到提高。同时,转基因香蕉植株冷响应基因表达量较野生对照也发生了显著变化。这些结果表明:MpICE1和MpMYBS3转录因子在香蕉冷响应信号转导途径中发挥着重要的作用。3.沉默Foc TR4麦角甾醇生物合成途径两个关键基因抑制了香蕉枯萎病的发生为了验证寄主植物诱导基因沉默技术(HIGS)在防控香蕉枯萎病上的可行性,我们将Foc TR4两个关键基因FoERG6和FoERG11作为靶标基因,构建了干扰这两个关键基因的RNAi载体,随后对感病香蕉品种Cavendish进行了遗传转化,并成功得到了表达FoERG6和FoERG11 ds RNAs的转基因材料。分别采用温室接种和重病圃大田测试对转基因材料的抗病性进行了评价。温室接种测试结果:2个月龄的转基因香蕉和野生型伤根处理后,接种浓度为2×106 ml-1孢子悬浮液,14天后转基因材料香蕉枯萎病的发病率显著低于野生型;转基因材料根部香蕉枯萎病数量明显少于野生型;转基因材料根部Foc TR4病原菌麦角甾醇生物合成途径中两个关键基因FoERG6和FoERG11的表达量显著降低。重病圃大田测试结果显示:表达FoERG6和FoERG11dsRNAs的转基因香蕉植株可显著降低重病圃内香蕉枯萎病的发病率。4.“外源基因”清除载体的构建及清除效果验证本文将构建的“Gene-deletor”载体pBIN19-LFY-FLP导入拟南芥,成功获得了3株转基因纯合子株系,对其根、茎、叶、果荚、果实等GUS组织染色分析,发现我们统计的200颗拟南芥果实中,只有23颗有GUS蛋白活性,177颗拟南芥果实并没有检测到GUS蛋白活性,未被染色的果实初步表明外源基因已经被清除,果实清除效果达到88.5%,说明我们构建的载体在拟南芥中可以达到良好的清除效果。至于在香蕉中的清除效果,还待得到香蕉果实后进行后续分析验证。
【学位授予单位】:华南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S668.1;S436.68

【参考文献】
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