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《华南农业大学》 2016年
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芥蓝萝卜硫苷生物合成主要基因表达特性及功能鉴定

尹玲  
【摘要】:芥蓝(Brassica oleracea var.alboglabra Bailey),属于芸薹属,广泛分布于中国华南地区、台湾、日本及东南亚。芥蓝具有很高的营养价值,含有丰富的维生素C、硫苷、类胡萝卜素和酚类化合物等。硫代葡萄糖苷,简称硫苷,是植物中富含氮和硫的次生代谢物。硫苷及其衍生产物(异硫氰酸盐、硫氰酸脂和腈类),在植物防御反应、特殊风味形成和抗癌等方面具有特殊作用。根据侧链R的氨基酸来源不同,可以将硫苷分为脂肪族、芳香族及吲哚族硫苷。4-甲基亚磺酰丁基硫苷,又称萝卜硫苷,属于脂肪族硫苷,其降解产物为萝卜硫素。萝卜硫苷是十字花科植物中的重要次生代谢产物,具有抗癌、抗氧化和抑菌活性。本研究以不同萝卜硫苷含量的芥蓝为材料,克隆了3个萝卜硫苷生物合成结构基因BCAT4、MAM1、CYP79F1和3个调控基因MYB28、MYB29和MYB76的全长序列,进行同源性比对,构建系统进化树,并分析基因表达模式。另外,构建MYB28的超表达和RNAi载体,通过花药浸染法导入拟南芥以及农杆菌介导的遗传转化方法导入芥蓝,并测定转基因植株的基因表达水平和硫苷含量。本研究为通过基因工程手段提高芥蓝萝卜硫苷含量奠定了基础。研究结果如下:(1)从芥蓝中分别克隆到结构基因BCAT4(Genbank登录号:KP295464)、MAM1(Genbank登录号:KP295465)、CYP79F1(Genbank登录号:KP295466)和调控基因MYB28(Genbank登录号:KP723785)、MYB29(Genbank登录号:KP723786)和MYB76(Genbank登录号:KP723787)。序列分析表明,BCAT4的cDNA全长序列1394bp,5'非翻译区42bp,最大开放阅读框1143bp,3'非翻译区209bp,编码380个氨基酸,编码的假定蛋白质的分子量为42kDa,等电点为9.09。MAM1的cDNA全长序列1560bp,5'非翻译区291bp,最大开放阅读框1164bp,3'非翻译区105bp,编码387个氨基酸,编码的假定蛋白质的分子量为42kDa,等电点为5.99。CYP79F1的cDNA全长序列1685bp,5'非翻译区27bp,最大开放阅读框1626bp,3'非翻译区32bp,编码541个氨基酸,编码的假定蛋白质的分子量为61kDa,等电点为8.26。MYB28的cDNA全长序列1257bp,5'非翻译区138bp,最大开放阅读框1020bp,3'非翻译区99bp,编码339个氨基酸,编码的假定蛋白质的分子量为38kDa,等电点为6.87。MYB29的cDNA全长序列1081bp,5'非翻译区24bp,最大开放阅读框966bp,3'非翻译区91bp,编码321个氨基酸,编码的假定蛋白质的分子量为84kDa,等电点为5.07。MYB76的cDNA全长序列1066bp,5'非翻译区23bp,最大开放阅读框1017bp,3'非翻译区26bp,编码338个氨基酸,编码的假定蛋白质的分子量为88kDa,等电点为5.06。(2)运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了芥蓝萝卜硫苷合成相关结构基因(BCAT4、MAM1、CYP79F1)和调控基因(MYB28、MYB29和MYB76)在不同品种芥蓝和芥蓝不同部位以及不同发育时期的表达水平。结果表明,芥蓝萝卜硫苷合成相关基因具有组织表达特异性,主要在子叶、叶片和茎中表达,子叶、叶片和茎中基因表达量高于花和种子。芥蓝萝卜硫苷合成相关基因在叶片不同发育时期的表达量不同,主要在成熟叶中表达,成熟叶的基因表达量高于幼叶。芥蓝萝卜硫苷合成相关基因表达水平与其相应的萝卜硫苷含量一致。成熟前期(萝卜硫苷含量低)的BCAT4、MAM1和MYB28表达量高于商品成熟后期(萝卜硫苷含量高),而成熟前期的CYP79F1、MYB29和MYB76表达量则低于商品成熟后期。(3)根据芥蓝萝卜硫苷合成基因MYB28的cDNA序列设计特异引物,经PCR扩增,得到约1200 bp目的片段,将目的片段连接到T载体上,用BamHI和SmaI双酶切,回收小片段,再和回收到的pFGC5941载体片段转化大肠杆菌感受态细胞。挑取单菌落,提取质粒,用BamHI和SmaI双酶切检测,然后利用冻融法,把构建好的超表达载体转到农杆菌EHA105中保存。同时,根据芥蓝萝卜硫苷合成基因MYB28的cDNA序列设计特异引物扩增出270bp的干扰片段,按照相反方向分别连接到pFGC5941载体上,成功构建了RNAi表达载体。(4)通过花序浸泡法转化拟南芥。通过农杆菌介导的遗传转化方法将载体导入芥蓝。PCR和Southern杂交检测结果表明MYB28基因已转入拟南芥和芥蓝中。分析转基因植株的脂肪族硫苷合成基因表达水平,测定转基因植株的脂肪族硫苷含量。结果表明,转基因植株的形态学特征并未发生改变。超表达植株中,脂肪族硫苷合成基因表达水平上升,脂肪族硫苷含量升高,其中超表达芥蓝萝卜硫苷含量增加97%。RNAi植株中,脂肪族硫苷合成基因表达水平下降,脂肪族硫苷含量降低。
【学位授予单位】:华南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S635.9

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