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《华南农业大学》 2016年
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新发H10N8亚型禽流感病毒适应哺乳动物分子机制的研究

肖陈城  
【摘要】:禽流感病毒作为一种重要的人畜共患病病原,不仅能感染禽类,还时常感染哺乳动物,直接或间接导致流感在人类的散发或大流行。禽流感病毒共有16个HA亚型以及9个NA亚型,正常情况下禽流感病毒由于对人唾液酸受体较低的亲和性使得其不能直接感染人。但抗原的突变及基因片段的重组使得流感病毒能够快速的进化,严重威胁着畜禽养殖业及人类的公共卫生安全。继2013年我国东部地区首次出现人感染H7N9禽流感病毒的疫情后,同年12月,江西省又报道了首例人感染H10N8禽流感病毒的事件,患者于住院后9天死亡。目前感染H10N8流感病毒共3人,其中死亡2人。关于H10N8流感病毒的研究表明其受体结合嗜性更偏好禽类受体。但关于此毒株的其他信息尚不明确,有待进一步探索。本研究选取H10N8疫情发生同时期分离的两株H10N8毒株,一株毒株为人源A/Jiangxi-Donghu/346-1/2013(H10N8),简称JX346,另一株为禽源A/Chicken/Jiangxi/102/2013(H10N8),简称JX102。对它们生物学特性的研究表明:人源毒株JX346相对于禽源毒株JX102,在体外哺乳动物源的MDCK、HEK293T以及禽源DF-1细胞上表现出更强的增殖能力。JX102对小鼠无明显致病力,MLD50106EID50,而JX346表现出更强的致病力(MLD50=102.25EID50),106EID50的攻毒剂量,攻毒后小鼠在5d内全部死亡,且小鼠脑内也能检测到病毒。利用流感病毒的反向操作技术,分别以两株病毒为骨架,对内部基因片段进行单一替换。重组病毒的小鼠试验结果显示,当JX102替换了JX346毒株的PB2片段后,即重组病毒JX102-JX346 PB2,对小鼠表现强致病力,106EID50的剂量攻毒后5d小鼠全部死亡。同样的,JX346替换了JX102毒株的PB2片段后,即重组病毒JX346-102PB2,对小鼠的毒力显著减弱,肺组织脏器滴度明显下降,攻毒后小鼠未出现死亡,且体重持续上升,且其他基因的替换无明显影响。这一结果表明,PB2基因是H10N8禽流感病毒致病的关键因素。对两株病毒PB2蛋白的氨基酸序列比对分析共发现11个氨基酸位点的差异,其中的627E/K为常见的禽流感病毒适应哺乳动物的关键位点。利用单点突变技术发现,627K是JX346致病力的关键但不是唯一因素,JX346-PB2 627E仍对小鼠表现出较强毒力(MLD50=103.5EID50)。以JX346-PB2 627E为骨架,对其他差异位点进行突变,最后结果发现87e、292v、340k、588v、648v及676m等位点与jx346毒株的强致病性相关。位于pb2627区域(domain)的588v的突变使得jx346-pb2627e病毒在哺乳动物细胞上的聚合酶活力降低了约80%。进一步的研究发现pb2a588v的单点突变增强了禽源h10n8毒株、h7n9毒株及h9n2毒株在哺乳动物细胞上的聚合酶活力及增殖能力以及增强了这些毒株对小鼠的致病性。对流感病毒数据库中的流感pb2的序列分析发现,pb2-588v毒株在h10n8、h7n9及h9n2毒株中的比例在2013年以后逐渐增多。以上结果表明,pb2蛋白的588位点可能是禽流感病毒适应哺乳动物的另一种新的形式。在发现588位缬氨酸的重要作用后,我们对不同亚型禽流感病毒的pb2588位点进行了分析,发现不同亚型流感病毒的pb2588位点有着各自特异的氨基酸分布。为了弄清这些氨基酸对禽流感病毒适应哺乳动物的影响以及588位点适应哺乳动物的分子机制,我们以jx102为模型,将性质相似的脂肪族氨基酸(t、i、l、s、g)引入jx102pb2蛋白的588位点,通过体内体外的实验研究这些氨基酸对病毒生物学特性的影响。结果显示,588v、588t、588i及588l能明显增强病毒在哺乳动物细胞上的聚合酶活力和增殖能力,而588s则无明显作用,588g则有反作用。动物实验结果表明,588v、588t、588i及588l毒株均对小鼠表现致死性,il-6、tnf-α、ip-10等炎性细胞因子在攻毒小鼠肺组织的mrna水平明显高于亲本毒(4-6倍),肺组织出现严重的炎性细胞渗出及出血等病理特征。对pb2588位点适应哺乳动物的机制进行探索发现与sirna的阴性对照组相比,在a549细胞上沉默importin-α1后,588v、588t、588i及588l的聚合酶活力降低了约50%,且增殖能力也显著减弱。而沉默其他核输入蛋白,如importin-α3、α4、α5及α7则无减弱现象。以上结果表明,禽源h10n8流感病毒pb2蛋白588位点适应哺乳动物可能受宿主蛋白importin-α1调控。综上所述,本课题研究了新型h10n8禽流感病毒的生物学特性,发现人源毒株jx346对小鼠呈高致病力,并且这种强致病力与其pb2蛋白上的87e、292v、340k、588v、627k、648v及676m等位点有关。进一步的研究人源h10n8毒株上发现的pb2588位点的单点突变(a→v)能同时增强禽源h7n9、h9n2亚型禽流感病毒对哺乳动物的适应性。而pb2588位点增强哺乳动物适应性与宿主蛋白importin-α1密切相关,这一发现为H10N8及H7N9、H9N2禽流感病毒的治疗和预防提供了理论依据。
【学位授予单位】:华南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S852.65

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