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《华南农业大学》 2018年
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小鼠胸腺上皮细胞miRNA和mRNA的年龄及性别差异性表达与功能研究

贾红玲  
【摘要】:胸腺作为中枢免疫器官,是T细胞分化、发育和成熟的场所,在机体免疫系统中具有极其重要的作用。随着年龄增长,胸腺逐渐退化,体积变小,初始T细胞输出能力逐渐降低导致机体免疫力下降及免疫衰老。除年龄因素外,胸腺退化还有性别差异,有文献报道,与雄性动物相比,雌性动物的胸腺生长的时间更长,退化的速度更慢。然而,在胸腺退化过程中究竟是年龄因素还是性别因素占主导作用以及怎样发挥作用,在分子水平层面上的报道并不多。而高通量测序技术使得对一个物种的转录组进行细致全貌的分析成为可能,本项目通过研究1月龄和3月龄雌、雄小鼠miRNA和mRNA调控网络,从分子水平深入揭示年龄和性别差异对胸腺退化的影响,寻找抑制胸腺退化或促进胸腺再生的新方法。我们以1月龄雌性小鼠(1F)、1月龄雄性小鼠(1M)、3月龄雌性小鼠(3F)和3月龄雄性小鼠(3M)的胸腺上皮细胞(TECs)为研究对象,采用免疫荧光法、高通量测序、生物信息学分析、RT-qPCR等方法,对小鼠TECs进行鉴定,对小鼠TECs中的差异表达miRNAs和mRNAs进行分析和验证,研究了小鼠胸腺退化过程中这些miRNAs和mRNAs之间的调控关系,并探讨了这些miRNAs和mRNAs对小鼠胸腺退化的年龄和性别差异的影响。随后,采用CCK-8法、流式细胞术、分子克隆、双荧光素酶报告基因、RNA干扰、RT-qPCR和Western blot等方法,对筛选出的年龄相关性miR-205-5p在小鼠胸腺上皮细胞系(MTEC1)中的生物学功能进行了研究,探讨了miR-205-5p在小鼠胸腺退化过程中的调控机制。研究结果如下:(1)高通量测序结果显示,在3F vs.1F TECs中鉴定出36个差异表达miRNAs,886个差异表达mRNAs;在3M vs.1M TECs中检测出214个差异表达miRNAs,3565个差异表达mRNAs;在3F vs.1F和3M vs.1M TECs中共同出现的差异表达miRNAs有23个,差异表达mRNAs有479个。在1M vs.1F TECs中鉴定出192个差异表达miRNAs,3351个差异表达mRNAs;在3M vs.3F TECs中鉴定出18个差异表达miRNAs,669个差异表达mRNAs;在1M vs.1F和3M vs.3F TECs中共同出现的差异表达miRNAs有8个,差异表达mRNAs有288个。(2)RT-qPCR结果表明,在3F vs.1F和3M vs.1M中共同出现的23个差异表达miRNAs中miR-183-5p、miR-199b-5p、miR-200b-3p和miR-205-5p极显著增加(P0.01)。这4个miRNAs可以作为小鼠胸腺发育和退化的分子标记物群。与雌性小鼠相比,在1M和3M的雄性小鼠中Arg1表达显著升高(P0.05);与雄性小鼠相比,在1F和3F的雌性小鼠中Cyplb1、Prkcb表达显著升高(P0.05),这3个基因(Arg1、Cyplb1、Prkcb)可以作为不同性别小鼠胸腺发育和退化的分子标记物群。(3)根据Target scan等软件预测了miR-183-5p、miR-199b-5p、miR-200b-3p和miR-205-5p的靶基因,根据miRNAs负调控靶基因的特性,把这些预测的靶基因与测序结果中3F vs.1F和3M vs.1M中下调的基因求交集,共有300个重叠基因。运用GO和KEGG分析这些重叠基因在小鼠TECs中的生物学作用,结果显示它们主要参与免疫、趋化因子等信号通路。对1M vs.1F和3M vs.3F的差异表达基因进行GO和KEGG分析,结果显示它们主要参与机体组织和细胞的发育生长、对刺激的调控应答及细胞的迁移等生物学过程。1M vs.1F的差异表达基因主要参与PI3K-Akt和趋化因子等信号通路,3M vs.3F的差异表达基因主要参与细胞因子受体和RAP1等信号通路。(4)对4个差异表达的miRNAs进行转录因子和结合靶基因预测,并对其中的5个重叠基因Ptpn4、Slc2a9、Pkib、Pecam1和Prkdc进行了验证,结果显示这些基因的表达与对应miRNAs的表达是负调控关系,这些基因主要参与生长发育和加速退化。(5)利用Cytoscape软件构建了miR-183-5p、miR-199b-5p、miR-200b-3p和miR-205-5p及其300个重叠基因的网络调控图,在这个网络调控图中许多重叠基因同时受这几个miRNAs调控。(6)CCK-8结果显示miR-205-5p能减少MTEC1细胞活力;流式细胞术检测结果显示miR-205-5p能引起G1阻滞,抑制MTEC1细胞增殖;双荧光素酶报告基因和Western blot结果表明Fa2h是miR-205-5p的靶基因。RNA干扰、RT-qPCR和Western blot结果表明Fa2h能正反馈调控Tfap2a的表达,流式细胞术检测结果显示Tfap2a和Fa2h能促进MTEC1细胞增殖。结论:(1)确定了小鼠胸腺上皮细胞miRNAs和mRNAs表达的年龄及性别差异,为以后在分子水平研究胸腺退化提供了数据库。(2)确定了4个差异表达miRNAs(miR-183-5p、miR-199b-5p、miR-200b-3p、miR-205-5p)和3个差异表达基因(Arg1、Cyplb1、Prkcb)可以分别作为不同年龄和不同性别小鼠胸腺发育及退化的分子标记物群。(3)确定了Fa2h是miR-205-5p的靶基因,Fa2h能正反馈调控Tfap2a表达,且Tfap2a和Fa2h促进MTEC1细胞增殖,而miR-205-5p通过靶向调控Fa2h表达抑制MTEC1细胞增殖。
【学位授予单位】:华南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S852.2

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