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《华南农业大学》 2018年
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F33:A-:B-耐药质粒的全序列分析及其在大肠杆菌中的传播特征研究

王晶  
【摘要】:质粒是肠杆菌中耐药基因在全球广泛传播的主要载体,携带耐药基因的质粒在不同地区、来源和菌种之间传播,给人类的健康造成极大威胁。因此,质粒介导的耐药基因传播引起全球的广泛关注。F33:A-:B-质粒在多种来源肠杆菌中发现,尤其是在国内动物源大肠杆菌中广泛流行,是bla_(CTX-M)、fosA3、rmtB和oqxAB等多种耐药基因传播的重要载体。本研究对不同来源F33:A-:B-耐药质粒进行结构分析,并调查该质粒在不同年代及不同来源大肠杆菌中的分布情况和质粒特征,以及探讨影响该质粒传播的因素。对18个从不同来源(动物、动物性食品和病人)大肠杆菌或肺炎克雷伯菌中获得的携带bla_(CTX-M)的F33:A-:B-质粒进行结构解析,结果发现除pHNAH9缺失大量骨架片段外,F33:A-:B-质粒骨架结构(复制区、先导区和接合转移区)高度相似,但yddA和traD重复序列个数不尽相同,且仅6个质粒存在II型内含子。F33:A-:B-质粒可变区结构多变,根据耐药基因、插入序列和其它Inc型质粒片段(IncI1、IncN1和IncX1)的携带情况将其分为四类,均插入到沉溺系统pemI/pemK的下游;其结构差异可能与插入序列如IS26、IS1294等介导的分子重排、插入和/或缺失有关。对2013~2016年从安徽某鸡场和猪场分离到的636株大肠杆菌进行IncFII33的检测,结果发现IncFII33在鸡源大肠杆菌中的检出率为14.20%(45/317),四年的检出率从5.43%到20.63%不等;猪源检出率仅为4.08%(13/319),且直到2015年才检测到IncFII33。通过接合或转化实验,共获得35个对头孢噻肟耐药的F33:A-:B-单质粒,大小在54.7~160 kb之间。除1个F33:A-:B-质粒携带bla_(NDM-1)外,其余质粒均携带bla_(CTX-M),包括bla_(CTX-M-55)(n=28)、bla_(CTX-M-65)(n=5)和bla_(CTX-M-3)(n=1)。耐药基因fosA3、rmtB、strAB、sul2、floR、tetA、aph(3')-IIa和oqxAB则分别在33、20、14、14、11、11、7和6个质粒中检测到。80%(n=28)的F33:A-:B-质粒同时携带3~9种耐药基因。此外,共有16个F33:A-:B-质粒上存在IncI1、IncN或IncX质粒片段,其中3个质粒同时存在IncI1、IncN和IncX片段,2个质粒携带IncX和IncN/IncI1片段,11个质粒仅含其中一种。虽然F33:A-:B-质粒大小不一,携带的耐药基因和其它质粒片段等也有明显差异,但在同一养殖场或不同养殖场之间也可能存在相同或极为相似的F33:A-:B-质粒。对广州市不同来源(食品动物、宠物、动物性食品以及医院人源)分离到的1481株大肠杆菌进行IncFII33的检测。结果显示,鸡源大肠杆菌检出率最高(13/137,9.49%),其次为鸡肉源(8/99,8.08%)和宠物源(6/128,4.69%),猪源(7/372,1.88%)和猪肉源(4/247,1.62%)检出率相近,人源最低(6/498,1.2%)。44株大肠杆菌共获得40个F33:A-:B-单质粒,大小在70~145.8 kb之间。全部质粒携带bla_(CTX-M),包括bla_(CTX-M-55)(n=38)和bla_(CTX-M-65)(n=2);fosA3、strAB、floR、tetA、sul2、rmtB、oqxAB和aph(3')-IIa则分别在39、17、17、17、17、9、8和7个F33:A-:B-质粒上检测到。40个F33:A-:B-质粒中,最少携带1种耐药基因(n=1),最多携带9种耐药基因(n=3),最常见的是同时携带bla_(CTX-M-55)-fosA3(n=15),其余21个则携带3~8种耐药基因。另外,共21个F33:A-:B-质粒携带1~3种其它质粒片段(IncI1、IncN和IncX)。F33:A-:B-质粒表现出明显的差异性和多样化,但在相同或不同来源大肠杆菌中也存在相同或极为相似的质粒。通过质粒稳定性、适应性和不同温度下的接合频率探讨影响F33:A-:B-质粒传播的因素。在没有抗菌药物压力下,18个F33:A-:B-质粒在受体菌DH5α中可稳定存在。F33:A-:B-质粒可在体外显著提高菌株的适应性,仅pHNAH9存在适应性代价。而在小鼠体内,所有F33:A-:B-质粒均能不同程度地提高菌株的适应性。选取7个F33:A-:B-质粒测定接合频率,结果37℃时F33:A-:B-质粒的接合频率在10~(-3)~10~(-2)之间;39℃和42℃时的接合频率相比37℃上升2~15倍不等,除pHNHNC02外均在42℃时接合频率最高;30℃时接合频率则显著降低约12~72倍;说明在30℃到42℃间,F33:A-:B-质粒的接合频率可能随温度的上升而升高,这可能也是F33:A-:B-质粒在动物尤其是鸡中较为流行的原因之一。综上所述,不同来源F33:A-:B-质粒可能来自同一祖先,通过插入序列等介导的不同重组事件进化形成。F33:A-:B-质粒介导bla_(CTX-M)、bla_(NDM)、fosA3、rmtB、floR、strAB、tetA、oqxAB等多种耐药基因的传播,在食品动物、宠物、动物性食品和病人中均有分布,主要在鸡中流行;且该质粒在大肠杆菌水平传播的过程中不断进化,形成不同的F33:A-:B-流行质粒谱系。F33:A-:B-质粒的多重耐药、良好的稳定性、适应性优势和较高的接合频率可能共同促进该质粒在肠杆菌尤其是大肠杆菌中的广泛传播。
【学位授予单位】:华南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S852.612;R378.21

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