收藏本站
《华南农业大学》 2018年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

卵黄抗体对黄曲霉毒素B_1的降毒效应及机制研究

邱涛涛  
【摘要】:黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFs)是一类由真菌寄生曲霉菌、黄曲霉菌等产毒菌株产生的次生代谢产物,广泛存在食品和饲料中。其中,以黄曲霉毒素B_1(Aflatoxin B_1,AFB_1)的肝毒性、基因毒性和免疫毒性最强。卵黄免疫球蛋白(Egg Yolk Immunoglobulin,IgY)又称卵黄抗体,存在于经特定抗原免疫禽类的蛋黄中,与哺乳动物血清IgG具有相同特性,能与抗原特异性识别结合。已应用于婴幼儿食品和畜禽饲料中,抵抗病毒和细菌性疾病的侵害。另对IgY研究发现,IgY还可以有效识别大分子蛋白毒素如蛇毒、细菌外毒素等,起到降低毒素毒性的作用。目前,卵黄抗体对小分子毒素的降毒效应缺少基础研究。本研究首次探讨IgY对小分子毒素的降毒效应和其机制。以小分子真菌毒素AFB_1为研究对象,小分子真菌毒素ZEN设为对照,合成半抗原后偶联成人工全抗原,免疫蛋鸡制备得到高纯度和特异性IgY。建立细胞染毒模型探讨抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导细胞毒性、功能紊乱和基因毒性的抑制作用;以及在其它细胞系中对AFB_1诱导细胞毒性的抑制作用;同时建立体内AFB_1诱导肝损伤模型和代谢实验,探讨抗AFB_1-IgY降低AFB_1诱发肝基因毒性和氧化损伤效应机制。本论文的主要研究成果及结论总结如下:⑴制备出高纯度和特异性抗AFB_1-IgY采用加成法AFB_1与乙醇酸(GA)合成半抗原AFB_1-GA,ZEN与羧甲氧基胺半盐酸盐(CMO)反应合成半抗原ZEN-CMO,再通过活泼酯法将AFB_1-GA和ZEN-CMO半抗原与载体蛋白(BSA和OVA)偶联制备AFB_1-GA-BSA和ZEN-CMO-BSA人工抗原,免疫蛋鸡,收集鸡蛋。采用酸性条件下水稀释法和微孔过滤提取蛋黄水溶液,结合盐析法和大分子沉淀法纯化IgY,获得高纯度IgY,纯度为~94%。实验发现抗原不同,蛋黄中抗体活性随免疫时间的变化情况也不尽相同,用AFB_1-GA-BSA和ZEN-CMO-BSA免疫蛋鸡,均能产生IgY,但产生的活性和时间不同,AFB_1-GA-BSA免疫蛋鸡产生IgY的抑制率较高,获得高活性IgY的时间相对较短。本实验中制备的抗AFB_1-IgY对抗原AFB_1的灵敏度较高,最低检测限LOD为0.06ng/mL,IC_(50)为2.4ng/mL,检测线性范围为0.13~32.8ng/mL,对AFB_2、交叉反应率均低于5%,而AFG_1和AFG_2交叉反应率均低于0.1%,反应出抗AFB_1-IgY对AFB_1有很好的特异性、识别和结合能力。制备的抗ZEN-IgY对抗原ZEN的灵敏度表现相对较低,最低检测限LOD为9.27ng/mL,IC_(50)为83.76ng/mL,检测线性范围为13.78~508.85ng/mL,对玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的交叉反应分别小于:85%,20%和20%;而对AFB_1和赭曲霉毒素的交叉反应小于2%,反应出ZEN-IgY对ZEN有一定的识别和结合能力,但特异性较差。⑵体外抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导细胞毒性、功能紊乱和基因毒性的抑制作用建立人正常肝细胞L-02体外染毒模型,研究抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导细胞毒,功能紊乱(活性氧化产物和线粒体膜电位和基因毒性的抑制作用。结果显示分别添加0.125μM、0.25μM和0.5μM抗AFB_1-IgY与100μM AFB_1于培养基中与L-02细胞孵育48h后,细胞的存活率明显升高、凋亡数量下降、周期阻滞和线粒体膜电位变化得到缓解、活性氧化产物降低、DNA损伤改善。并且随着抗AFB_1-IgY浓度的增加,相对AFB_1处理组抑制凋亡蛋白BCL2和survivin的表达水平随之增加,而促凋亡蛋白caspase-3和BAX的表达水平随之降低,实验结果显示抗AFB_1-IgY本身对细胞凋亡蛋白并没有调节作用,细胞的抗氧化蛋白CAT和SOD1的表达水平亦没有随着抗AFB_1-IgY的增加活性增加。AFB_1进入细胞终产物AFB_1-DNA的浓度检测发现随着抗AFB_1-IgY的添加,形成的AFB_1-DNA加合物浓度逐步降低。综合以上实验结果:随着抗AFB_1-IgY的添加,抗AFB_1-IgY与AFB_1的特异性识别结合后形成蛋白大分子复合物,此复合物不能被细胞所吸收,AFB_1进入细胞量减少,随之降低AFB_1诱导的细胞毒性、功能紊乱和基因毒性。⑶其它细胞系中抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导细胞毒性的抑制作用基于AFB_1主要靶器官肝脏、肠道和生殖系统,选取人肝癌细胞HepG2、人结肠癌细胞HTC-8和人孕早期滋养层细胞Swan 71作为研究对象,建立三种细胞AFB_1的染毒模型,进一步补充、丰富抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导细胞毒性的抑制作用数据。结果显示抗AFB_1-IgY能降低AFB_1对三种细胞存活率的抑制,及AFB_1诱导HTC-8细胞的凋亡,存在明显的剂量效应关系;通过transwell实验发现抗AFB_1-IgY能降低AFB_1抑制Swan 71细胞的侵袭和迁移功能。以上结果表明,在其它细胞系中抗AFB_1-IgY同样具备对AFB_1诱导细胞毒性抑制能力,推测机体同时摄入抗AFB_1-IgY和AFB_1后,能降低AFB_1对机体的肝毒性、生殖毒性及肠道损伤。⑷抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导大鼠肝基因毒性和氧化损伤的预防作用为探讨抗AFB_1-IgY对AFB_1诱导大鼠肝基因毒性和氧化损伤抑制作用及机制。通过体外实验确定抗AFB_1-IgY和AFB_1体外结合比例,建立AFB_1诱发大鼠肝损伤模型和AFB_1代谢实验。实验结果显示抗AFB_1-IgY是一种有效的营养保护剂,可以抑制AFB_1诱发早期肝脏损伤生化标志物变化,但IgY并不是通过增加抗凋亡蛋白表达和抗氧化酶活性来实现对肝的保护。进一步AFB_1在血液、尿液、肝脏和粪便的代谢产物研究发现中高剂量抗AFB_1-IgY与AFB_1共同处理大鼠后,AFB_1-DNA加合物分别减少了43.3%和52.9%;AFB_1-alb分别减少了10.5%和21.1%;AFB_1-N~7-gua分别减少了19.6%和34.4%,粪便中AFB_1增加了约2倍,AFB_1-DNA、AFB_1-alb和FB_1-N~7-gua是AFB_1诱导机体基因毒性的标志产物,结果证实抗AFB_1-IgY是通过抑制AFB_1的吸收起到基因毒性预防作用。实验结果证实抗AFB_1-IgY能够识别并结合小分子毒素AFB_1,形成非共价复合物,减少机体对AFB_1吸收,降低小分子毒素AFB_1对肝脏组织的基因毒性和氧化损伤。本研究首次为口服IgY抑制动物体内小分子毒素的摄取提供了实验依据。综上所述,抗AFB_1-IgY对AFB_1具有潜在的降毒作用。在体外实验中抗AFB_1-IgY通过与AFB_1的结合,减少了AFB_1进入细胞所诱发的细胞毒性、细胞功能紊乱和基因毒性。在体内实验中抗AFB_1-IgY通过与AFB_1形成的非共价复合物,减少胃肠道对AFB_1的吸收,降低AFB_1诱发肝基因毒性和氧化损伤。本研究增加了抗体新的应用途径,为脱除小分子毒素提供了一种新的思路。
【学位授予单位】:华南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R392

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王文文;和七一;刘刚;余晓东;;卵黄抗体(IgY)及其在蛇伤治疗中的研究进展[J];重庆师范大学学报(自然科学版);2015年06期
2 李少晖;任丹丹;谢云峰;刘佳;杨永坛;;食品中黄曲霉毒素检测方法研究进展[J];食品安全质量检测学报;2015年04期
3 罗自生;秦雨;徐艳群;徐庭巧;魏云潇;何良兴;;黄曲霉毒素的生物合成、代谢和毒性研究进展[J];食品科学;2015年03期
4 叶盛群;谌刚;韩秀山;;食用油吸附脱色剂对植物油中黄曲霉毒素含量的影响[J];精细与专用化学品;2013年07期
5 凌丽君;刘萱;曹诚;;线粒体锚定对凋亡诱导因子抗氧化应激功能的影响[J];生物技术通讯;2013年04期
6 赵宁毅;张婷;;中药小分子化合物人工抗原的制备及鉴定[J];时珍国医国药;2012年07期
7 李超波;李文明;杨文华;杨小龙;曹郁生;;降解黄曲霉毒素微生物筛选中降解与吸附结合作用的区分[J];食品与发酵工业;2012年05期
8 汤天学;王刚;;推广使用绿色饲料添加剂[J];中国畜牧兽医文摘;2011年06期
9 王松雪;鲁沙沙;张艳;谢刚;王海鸥;;国内外真菌毒素检测标准制修订现状与进展[J];食品工业科技;2011年03期
10 韩水仲;田泽华;赵津子;张小莺;陈琛;;卵黄抗体在饲料添加剂中的应用[J];中国饲料;2010年15期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 蔡国林;徐铭乾;李秋;王珊珊;杜祖波;陆健;;解淀粉芽孢杆菌黄曲霉毒素B_1裂解酶的分离纯化及鉴定[J];食品与发酵工业;2015年12期
2 魏彪;张癸荣;张丹参;聂凌云;唐颜苹;;米诺地尔多克隆抗体的制备及其酶联免疫检测方法的建立[J];中国免疫学杂志;2015年12期
3 罗小虎;王韧;王莉;李永富;李亚男;陈正行;;粮食中黄曲霉毒素消减方法研究进展[J];粮食加工;2015年06期
4 张波;詹志来;康利平;袁媛;黄璐琦;丁凤伟;南铁贵;;木犀草苷人工抗原合成及免疫原性鉴定[J];中国中药杂志;2015年22期
5 王思宇;高新;李卫娟;杨维林;李银江;;常见霉菌毒素对畜牧生产的危害[J];饲料与畜牧;2015年10期
6 刘菁;毛新民;李琳琳;李新霞;王烨;兰怡;;小分子单克隆抗体的制备与敲除技术研究进展[J];中国中药杂志;2015年19期
7 李彩艳;梁志宏;黄昆仑;;黄曲霉群体感应研究进展[J];食品安全质量检测学报;2015年08期
8 邱妹;陈海燕;孙力军;王雅玲;徐德峰;聂芳红;励建荣;;低剂量T-2/HT-2毒素生物转化产物的遗传毒性研究[J];现代食品科技;2015年08期
9 秦美蓉;徐静华;刘远平;王平;冼静雯;王晓炜;;活泼酯法合成绿原酸人工抗原及其鉴定[J];沈阳药科大学学报;2015年05期
10 马婷;张婷;;胶体金免疫层析技术在天然小分子化合物检测中的应用[J];中国实验方剂学杂志;2015年12期
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王叶群;姚刚;张绍英;;污染黄曲霉毒素花生的检测及分选技术研究进展[J];农业工程;2014年06期
2 朱云;徐琳娜;艾兰红;高义标;;粮油产品中黄曲霉毒素检测方法研究[J];粮食科技与经济;2014年05期
3 李芳;黎琳琳;刘绪斌;沙力;李艳美;储晓刚;粟有志;雷红琴;;无需衍生化样品处理快速测定食品中黄曲霉毒素B_1[J];食品安全质量检测学报;2014年09期
4 陈彤;王常青;李小凡;郝志萍;;间接ELISA检测不同贮存条件下花生中黄曲霉毒素B_1[J];中国油脂;2014年09期
5 李可;丘汾;;免疫亲和层析-超高效液相色谱法测定大米中4种黄曲霉毒素[J];中国卫生检验杂志;2014年16期
6 韩玉刚;汪小舟;;超临界流体萃取技术的发展及应用[J];广东化工;2014年12期
7 罗小虎;王韧;王莉;李永富;沈利杨;王勇;陈正行;;高效液相色谱快速测定玉米中黄曲霉毒素的研究[J];中国粮油学报;2014年06期
8 周贻兵;刘利亚;李磊;林野;李雪春;;免疫亲和柱净化-光化学衍生高效液相色谱荧光法测定植物油中黄曲霉毒素B_1的含量[J];中国油脂;2014年06期
9 李庆川;曹立新;胡海峰;王凯;闫培生;;黄曲霉毒素电化学生物传感器[J];化学进展;2014年04期
10 牛军小;苏军;徐晓枫;李伟;单美娜;蒲云霞;;免疫亲和柱净化-反相高效液相色谱法检测乳与乳制品中黄曲霉毒素M1[J];中国卫生检验杂志;2014年07期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 汪恩婷;邹振宇;杨皓;杨京;;应用高效液相色谱法检测食品中黄曲霉毒素[J];食品安全导刊;2018年36期
2 彭永敏;;食品中黄曲霉毒素的检测方法[J];食品安全导刊;2018年36期
3 曹长会;;临沂市煎饼类食品中黄曲霉毒素含量测定及分析[J];中国卫生检验杂志;2019年05期
4 陈勇;荣道兴;任利民;;黄曲霉毒素对家禽的危害与防控措施[J];阿坝科技;2012年02期
5 李区;;黄曲霉毒素分析方法进展[J];广西水产科技;2005年03期
6 王少军;于春娣;唐娟;程果;谢晓丽;杨庆利;;黄曲霉毒素生物脱毒法研究进展[J];食品研究与开发;2018年24期
7 诸晨;钱勇;;高效液相色谱-质谱联用法测定薏苡仁药材中黄曲霉毒素[J];食品安全质量检测学报;2019年05期
8 邢天一;;液相色谱串联质谱法检测食品中的黄曲霉毒素实践探讨[J];农民致富之友;2017年23期
9 马冠生;;黄曲霉和黄曲霉毒素真那么可怕吗[J];生命与灾害;2017年11期
10 马亚伟;;猪饲料中黄曲霉素毒素危害与检测[J];农技服务;2017年19期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 乔宏兴;姜亚乐;王永芬;史洪涛;边传周;;黄曲霉毒素的危害及其脱毒方法研究进展[A];中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第五届第十三次全国学术研讨会论文集[C];2018年
2 孙淑娟;曾于洋;江海洋;;中药中黄曲霉毒素检测方法研究进展[A];中国毒理学会兽医毒理学委员会与中国畜牧兽医学会兽医食品卫生学分会联合学术研讨会暨中国毒理学会兽医毒理学委员会第5次全国会员代表大会会议论文集[C];2017年
3 胡丽莎;谢春芳;姚冬生;刘大岭;;用等温滴定微量热技术对黄曲霉毒素氧化酶动力的研究[A];第八届中国酶工程学术研讨会论文集[C];2011年
4 黎玉凤;张赛;谢春芳;刘大岭;姚冬生;;黄曲霉毒素解毒酶体外分子定向进化(Ⅱ)[A];第八届中国酶工程学术研讨会论文集[C];2011年
5 施晓晨;安雅男;申凤鸽;于录;;黄曲霉毒素诱导巨噬细胞自噬机制的研究[A];中国畜牧兽医学会兽医药理毒理学分会第十一届会员代表大会暨第十三次学术讨论会与中国毒理学会兽医毒理专业委员会第五次学术研讨会论文集[C];2015年
6 王文龙;李成成;安立龙;;简述环境中黄曲霉毒素对蛋鸡产业潜在的生态和健康风险[A];中国畜牧兽医学会2014年学术年会论文集[C];2014年
7 孟庆利;;黄曲霉毒素的检测及控制[A];《2010中国猪业进展》论文集[C];2010年
8 翁善钢;Kaori Nishide;;亚太地区的黄曲霉毒素[A];第十二届(2014)中国猪业发展大会论文集[C];2014年
9 陈建民;张雪辉;杨美华;金钺;;中药中黄曲霉毒素检测概况[A];第八届全国中药和天然药物学术研讨会与第五届全国药用植物和植物药学学术研讨会论文集[C];2005年
10 马静;朱惠莲;唐志红;凌文华;;尿粪黄曲霉毒素排泄及生物干预[A];中国环境诱变剂学会抗诱变剂和抗癌剂专业委员会第三次全国学术会议、中国毒理学会生化与分子毒理专业委员会第五届学术交流会、贵州省环境诱变剂学会成立大会暨首届学术交流会论文集[C];2004年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 马爱平;黄曲霉毒素超标“致命”怎么破?[N];科技日报;2018年
2 国家食品安全风险评估中心副研究员 钟凯;普洱茶中携带黄曲霉会不会产生毒素?[N];中国医药报;2017年
3 食品与营养信息交流中心副主任 钟凯;花生酱含黄曲霉 吃了会怎样[N];健康报;2017年
4 科信食品与营养信息交流中心副主任 中华预防医学会健康传播分会常务委员 钟凯;农家花生油既便宜又放心?[N];保健时报;2017年
5 美国普度大学农业与生物工程系博士 云无心;检测出黄曲霉毒素 普洱茶还能喝吗[N];保健时报;2017年
6 记者 季征;云南农大研究表明普洱茶不含黄曲霉毒素[N];云南日报;2017年
7 本报记者 付丽丽 马波;茶照喝 牙照刷[N];科技日报;2017年
8 本报记者 陈海波;喝普洱茶,真的会致癌吗[N];光明日报;2017年
9 南方日报见习记者 郜小平;普洱茶致癌?谣言![N];南方日报;2017年
10 记者 杨艳萍;普洱茶中不含黄曲霉毒素[N];昆明日报;2017年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 范彧;黄曲霉毒素降解酶基因克隆表达和降解剂在肉鸡中的应用研究[D];中国农业大学;2015年
2 邱涛涛;卵黄抗体对黄曲霉毒素B_1的降毒效应及机制研究[D];华南农业大学;2018年
3 郝澍;硒对黄曲霉毒素B_1抑制猪细胞免疫的拮抗作用及其机理研究[D];南京农业大学;2016年
4 关绚丽;基于转录组学的氧化胁迫下调控黄曲霉毒素合成的基因筛选和确证[D];中国农业科学院;2018年
5 史莹华;纳米级硅酸盐结构微粒(NSP)吸附猪饲粮中黄曲霉毒素的研究[D];浙江大学;2005年
6 胡娜;基因芯片技术在黄曲霉毒素生物合成相关基因检测中的应用研究[D];南昌大学;2006年
7 张雪辉;中药中黄曲霉毒素检测方法研究及模式识别在中药领域中的应用[D];中国协和医科大学;2004年
8 申海涛;黄曲霉毒素G_1诱发小鼠肺腺癌的组织发生及其对肺泡Ⅱ型上皮细胞影响的研究[D];河北医科大学;2007年
9 马良;黄曲霉毒素B_1高灵敏度检测技术研究[D];中国农业科学院;2007年
10 谢光洪;黄曲霉毒素B1免疫层析试纸条快速检测方法的研制[D];吉林大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王晓琼;黄曲霉毒素B_1对番鸭生产性能、脏器病理变化及血清生化指标的影响[D];华南农业大学;2018年
2 李声明;黄曲霉MAPK通路相关基因功能初步研究[D];福建农林大学;2015年
3 仲红;温度对黄曲霉生长发育和次级代谢的影响[D];福建农林大学;2015年
4 郭珍妮;水分胁迫对黄曲霉生长和产毒影响的初步研究[D];福建农林大学;2015年
5 叶柳青;曲古抑囷素A对黄曲霉产毒和生长调控机制的初步研究[D];福建农林大学;2015年
6 陈璐瑶;花生酱中黄曲霉毒素富集规律及其削减技术研究[D];福建农林大学;2018年
7 田尔诺;黄曲霉毒素B_1降解酶及其降解机制研究[D];湖北工业大学;2018年
8 马海艳;食品药品中痕量真菌毒素检测方法的研究与应用[D];河北医科大学;2018年
9 刘博伟;TNF-α上调CYP2A13对黄曲霉毒素G_1致肺泡上皮细胞损伤的影响[D];河北医科大学;2018年
10 李丽;槲皮素对黄曲霉毒素B_1致BRL-3A细胞毒性的保护作用[D];江南大学;2018年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026