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《华南农业大学》 2017年
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香蕉枯萎病菌天冬氨酸转氨酶基因克隆及致病作用研究

孙延超  
【摘要】:本实验室前期研究表明在不同细胞壁多糖诱导下香蕉枯萎病菌(尖孢镰刀菌古巴专化型,Foc)1号生理小种(Foc1)和4号生理小种(Foc4)的基因表达存在显著差异。本研究通过Foc中2小种转录组数据比较分析,筛选出5个差异表达基因,它们在Foc4中受细胞壁诱导高表达,而在Foc1中不受诱导表达,对它们在致病过程中的功能开展研究。BLAST比对结果显示,comp6613,comp6626,comp22765为未知功能基因,comp23886为编码天冬氨酸转氨酶基因,comp25382为锰离子转运相关基因。将Foc接种香蕉后提取香蕉根部RNA并对上述5个基因进行荧光定量PCR分析,结果显示comp23886表达量显著上调,在48 h较0 h上调350倍,96 h达到0 h的600倍;comp6626在Foc接种香蕉一段时间后表达量下调,其中comp6613,comp22765,comp25382在48 h和96 h的表达量较0 h上调,表达量上调最大可达到将近0 h的100倍,但上调表达情况都不及comp23886上调显著,因此本实验优先选择comp23886进行后续研究。通过NCBI BLAST比对,发现comp23886与水稻恶苗病菌中编码天冬氨酸转氨酶基因同源性达到99%,参考Orherrin等对大肠杆菌中天冬氨酸转氨酶编码基因aspC的命名,本研究将comp23886更名为aspC。克隆结果显示aspC在2小种中的序列相似度较高,Foc1-aspC和Foc4-aspC的DNA全长都为1314 bp,编码区长度为1218 bp,Foc1-aspC和Foc4-aspC都由3个外显子和2个内含子组成,外显子区域的同源性为98.7%。本研究运用TAIL-PCR技术得到Foc1-aspC、Foc4-aspC目的基因的侧翼序列,进而构建Foc1-aspC、Foc4-aspC敲除载体,并用ATMT法得到aspC缺失突变体Foc1-△aspC、Foc4-△aspC。Foc1-△aspC和Foc4-△aspC在PDA平板上培养的形态基本与野生型菌株形态一致,其菌丝生长的速度与野生型相比较慢,产孢量与野生型较低。本研究使用浸根接种的方法对敲除突变体的致病性进行验证,将Foc1-△aspC、Foc4-△aspC敲除突变体接种四叶期的蕉苗,虽然接种的香蕉仍出现香蕉枯萎病症状,但其中Foc4-△aspC敲除突变体接种巴西蕉后的发病时间较野生型Foc4接种巴西蕉延迟,且敲除突变体菌丝的生长速率与产孢量降低,证明aspC对Foc4致病性具有一定的影响。
【学位授予单位】:华南农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S436.68

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