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《华南农业大学》 2017年
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猪场环境中mcr-1的分布特征及在不同菌种间传播的初步研究

伍盛鋆  
【摘要】:mcr-1作为首个质粒介导的黏菌素耐药基因,引起全世界高度关注。耐药基因可通过水平转移和垂直传播从动物源耐药菌进入其周围环境,mcr-1基因在国内猪场检出率高,但其对猪场环境的污染情况尚不清楚。本研究拟对首次发现mcr-1基因的猪场环境中mcr-1基因的分布特征、污染来源以及传播扩散机制进行研究。从猪场采集猪粪便、猪舍土壤、废水、贯穿猪场的河流水体和沉积物样品共388份样品,提取样品中细菌总DNA,实时荧光定量PCR检测mcr-1的含量。结果显示该猪场各个环境样品中呈现不同程度的mcr-1基因污染,其丰度总体呈现出猪舍泥土粪便猪舍污水的分布特征。mcr-1基因在猪舍环境泥土中的富集大于污水中,差值在10~4倍之上,猪舍泥土长时间的不可移动性可能是mcr-1在此大量富集的原因。猪舍泥土中mcr-1的含量比粪便中的大,差值在100~1000倍之间,两者的含量变化具有一定的相似性。此外,河流底泥中的mcr-1基因丰度富集较大,中下游mcr-1基因的含量要比上游的大,差值在1000倍左右。同时利用含2 mg/L黏菌素的麦康凯琼脂板对这388份样品进行菌株分离,共获得458株耐黏菌素肠杆菌。PCR检测mcr-1基因,结果发现136株携带有mcr-1基因,包括129株大肠杆菌、4株阪崎肠杆菌和3株志贺氏菌,分别分离自粪便(n=69)、肛门拭子(n=52)、猪舍泥土(n=4)、粪便处理池(n=2)和河流底泥(n=2)。采用琼脂稀释法测定136株mcr-1阳性菌株对20种抗菌药物的敏感性,结果显示90%以上的mcr-1阳性菌株对四环素、氟苯尼考和复方新诺明耐药,耐药率分别为98.5%(134/136)、97.80%(133/136)和94.11%(128/136);对氨苄西林的耐药率达70%,对头孢噻肟的耐药率为30.15%(41/136),所有菌株都呈现不同程度的多重耐药现象。随机选取15株不同来源的mcr-1阳性大肠杆菌进行传播机制研究,包括猪舍泥土(n=4)、粪便处理池(n=1)、河流底泥(n=2)和不同日龄肛门拭子/粪便(n=8)。脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)结果显示菌株间不存在明显的亲缘关系。对22株mcr-1阳性肠杆菌(15株大肠杆菌、4株阪崎肠杆菌和3株志贺氏菌)进行接合转移试验以研究质粒的可转移性,19株接合成功,其中包括13株大肠杆菌、4株阪崎肠杆菌和2株志贺氏菌。对接合子进行S1-PFGE、杂交定位和复制子分型分析,结果发现4株阪崎肠杆菌的mcr-1位于IncX4(~33.3 kb,n=3)和IncP(~54.7 kb)型质粒上,2株志贺氏菌中mcr-1分别位于IncX2(~54.7 kb)和IncFII(~138.9 kb)型质粒,mcr-1基因在大肠杆菌中则分别位于IncX4(~33.3 kb,n=4)、IncX2(~54.7 kb n=3)、IncI2(n=2)、IncFII(~104.5 kb)和IncP(~54.7 kb)型质粒上。接合未成功的志贺氏菌中mcr-1位于约33.3kb的质粒上。相似mcr-1质粒在不同菌种中的检出提示mcr-1可通过质粒在不同菌种间水平传播。本研究结果表明mcr-1基因在猪场粪便和环境中广泛分布,可通过排泄物污染和污水排放等作用从养殖动物扩散到周围环境中。mcr-1基因位于不同的质粒上,主要包括IncX4、IncP、IncX2等质粒,在不同来源和菌种中均有检出,表明mcr-1质粒在猪场环境中发生水平传播。
【学位授予单位】:华南农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.6

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