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《华南农业大学》 2017年
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K亚群禽白血病病毒抗体间接ELISA检测方法研究

袁丽霞  
【摘要】:禽白血病(Avian Leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引起的鸡良性或恶性肿瘤性疾病。自报道以来,AL给世界各地养禽业造成了较大的经济损失。至今,尚无有效的药物对患病鸡群进行治疗,也没有可靠的疫苗对健康鸡群进行预防,只能通过剔除阳性鸡等措施减少和净化外源性ALV。ALV属于反转录RNA病毒,容易变异,其gp85基因决定了亚群特异性。根据病毒的囊膜蛋白特性曾将ALV分为10个亚群,分别为ALV-A至ALV-J亚群。近年来,我国报道发现了新的ALV亚群,被命名为K亚群(ALV-K)。但对于ALV-K的相关研究较少,也没有检测ALV-K抗体的商品化试剂盒。本研究以一个ALV-K分离株(GDFX0603毒株)cDNA为模板,经过特异性引物PCR扩增其gp85基因,连接于pMD18-T载体上,转化菌液经PCR鉴定与测序。结果表明,克隆载体中的目的基因gp85序列与该毒株发表的gp85序列完全一致;利用扩增得到的目的基因经T_4连接酶连接到pET32a载体的Bam H I与Sal I酶切位点之间,构建原核表达重组质粒pET-GDFX0603-gp85,经酶切和测序鉴定成功后转化于BL21感受态细胞中,筛选表达菌液的诱导表达条件,SDS-PAGE试验结果表明,最佳诱导表达时间为6 h、最佳诱导表达温度为37°C、IPTG最佳诱导表达浓度为0.7 mM,并在优化后的最佳工作条件下进行了重组蛋白的大量表达。结果表明,诱导表达的蛋白产物主要以包涵体形式存在,大小为53 ku。为了获得高纯度的蛋白,用Ni柱纯化了表达的重组蛋白,SDS-PAGE试验结果表明纯化后的目的蛋白条带清晰单一。Western blotting结果表明重组蛋白的免疫反应性良好。为了建立ALV-K抗体间接ELISA检测方法,用表达好的ALV-K gp85蛋白进行包被,确定间接ELISA方法最佳反应条件。结果表明PBS缓冲液(pH=7.6)为最佳包被液、最佳抗原包被浓度为5μg、1:200为最佳血清稀释度,最佳血清作用时间为60 min、最佳二抗稀释度确定为1:3000,最佳二抗反应时间为45 min、最佳底物显色反应时间为10 min。临界值结果表明,试验中的阴性血清的平均值为0.271,标准偏差为0.019,阴阳性临界值为0.325。重复性试验结果表明在ELISA板内样品重复性的CV最小值为2.54%,最大值为10.41%;在ELISA板间样品重复性的CV最小值为3.62%,最大值为12.57%,CV值均小于15%。将本论文建立的ELISA方法对禽流感病毒(AIV)、马立克氏病病毒(MDV)、新城疫病毒(NDV)、禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、大肠杆菌、沙门氏菌以及ALV-A、ALV-B、ALV-J的阳性血清进行特异性检测,结果表明本论文建立的ALV-K抗体间接ELISA方法除了对ALV-A阳性血清有弱的交叉反应外,对ALV-B、ALV-J、AIV、NDV、IBDV、MDV、REV、大肠杆菌和沙门氏菌的阳性血清均无交叉反应。利用所建立的ALV-K抗体间接ELISA方法对ALV-K人工感染试验中的32份鸡血清样本进行检测,结果表明32份鸡血清中有18份血清的ALV-K抗体为阳性,血清阳性率为56.25%。本论文建立的ALV-K抗体间接ELISA方法将有助于ALV-K血清学筛查,同时有利于ALV-K抗体检测试剂盒的研发。
【学位授予单位】:华南农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65

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