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《华南农业大学》 2017年
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薯蓣皂苷类化合物作用H5N1禽流感病毒包膜蛋白HA的活性研究

石婉真  
【摘要】:H5N1高致病性禽流感病毒,属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)流感病毒属,甲型流感病毒的一种亚型,可致人畜共患,具有传染性强、传播速度快、高致病性的特点。H5N1禽流感首次是在1996年中国广东的家鹅中被发现,随后在中国大陆、泰国、越南、印尼、加拿大、尼日利亚等全球多地的禽类和鸟类中爆发疫情,对发病鸡的致死率高达100%,给全球养禽业带来了巨大的经济损失;人感染H5N1禽流感病毒后致死率高达60%,对人类的健康安全构成了严重的威胁。目前针对H5N1高致病性禽流感的防控,主要以接种疫苗预防为主,但由于H5病毒变异不断发生,疫苗都无法提供及时和全面防护,而且目前缺乏人用的H5亚型禽流感病毒的治疗性抗体。因此,其防控还须依靠药物。当前,WHO推荐使用的H5N1高致病性禽流感病毒的有效药物—神经氨酸酶(NA)抑制剂(奥司他韦和扎那米韦)已出现耐药株,所以各国不能单纯依赖奥司他韦(达菲)类药物预防和治疗H5N1亚型禽流感。因此,加强研究有效防控H5N1禽流感的新型药物,尤其是新作用靶点及作用机制明确的药物或先导化合物是当前的重要课题。近年来,包膜血凝素(HA)蛋白抑制剂用于H5N1病毒感染的防治研究受到关注。HA蛋白抑制剂具有明显的优势,能在病毒感染的早期阶段阻断入侵,降低血浆病毒载量,为H5N1禽流感的防治提供新的药物组合。前期研究发现,薯蓣皂苷类化合物可在H5N1亚型流感病毒入侵宿主细胞环节起作用,本课题组在活性化合物XC-27基础上,设计合成了多个化合物,开展了深入的抗H5N1亚型流感病毒的活性研究,并探讨其作用机制。本实验利用MTT及空斑减少中和试验方法,观察化合物对H5N1禽流感活病毒入侵MDCK细胞的抑制作用,结果证实,化合物XC-27-1、XC-27-2、UA-Nu-ph-5可以在MDCK细胞染毒的早期阶段,抑制H5N1禽流感病毒的入侵。为了寻找化合物的作用靶点,本实验通过构建3个质粒的A/Thailand/kan353/2004野生型H5N1假病毒高通量筛选体系,发现化合物XC-27-1、XC-27-2均能较好的抑制H5N1野生型假病毒,IC_(50)值分别是12.76±7.01μM、18.47±1.82μM。进一步神经氨酸酶抑制试验结果表明,两个化合物即使在400μM的高浓度下对神经氨酸酶抑制作用微弱,不抑制H5型血凝素蛋白介导的鸡红细胞凝集反应,结果暗示,两个化合物能选择性作用于HA蛋白,但结合部位不在唾液酸受体结合位点(RBD)。为进一步阐释化合物与H5N1禽流感病毒HA蛋白的相互结合,本研究根据PDB数据库中HA蛋白晶体结构及亲本野毒株HA基因序列,构建了HA受体结构模型,通过分子对接,预测了可能的结合模式及相互对接的氨基酸残基,认为I48、L329、T331、W367、T387、I391、V394、T395为分子对接的可能相关残基,定点突变法验证发现,血凝素蛋白I391、T395等氨基酸残基突变后,XC-27-1、XC-27-2对H5N1亚型重组病毒感染MDCK细胞的抑制能力显著下降,IC_(50)值上升5倍以上,说明两个化合物的结合部位可能位于HA茎干和球状头部的相邻区域,I391、T395氨基酸残基为主要结合位点;进一步地,利用生物膜干涉技术(BLI)研究了两个化合物与H5N1亚型病毒HA蛋白的结合能力,结果显示化合物能特异性结合HA蛋白,结合亲和力常数(KD)值分别为2.57×10~(-4)、3.67×10~(-4)。
【学位授予单位】:华南农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65

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