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《华南农业大学》 2017年
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2015~2017年我国部分地区H9N2亚型AIV遗传演化分析和生物学特性的研究

刘兆洁  
【摘要】:H9N2亚型AIV自1994年首次在中国分离以来,逐渐成为中国大陆流行的禽流感病毒亚型之一,并在我国大部分地区广泛传播。近年来,H9N2亚型AIV不仅给我国养禽业发展造成了严重的影响,还能发生基因重组,突破宿主屏障,实现跨宿主传播,感染人和其他哺乳动物,对公共卫生安全产生一定的威胁。因此,对我国近年来H9N2亚型AIV进行遗传演化分析和生物学特性的研究具有重要意义。本研究对我国部分地区(山东、河南、湖南、云南、广西、广东)在2015~2017年分离到的75株H9N2亚型AIV分离株的HA基因进行遗传演化分析,挑选具有代表性的14株分离株进行全基因组的遗传演化分析、生物学特性的研究,并选取其中的7株进行抗原性分析,4株研究其对4周龄SPF鸡和4周龄SPF级BALB/c小鼠的致病性特点。HA基因遗传演化分析表明:14株分离株有13株分离株的HA基因位于BJ/94-like分支(h9.4.2)上,1株分离株位于G1-like分支(h9.4.1)上。BJ/94-like分支(h9.4.2)又可细分为两个不同的亚分支:一个分支是以分离株A/chicken/Guangxi/55/2005(h9.4.2.5)为代表的亚分支,另一个是以分离株A/chicken/Guangdong/FZH/2011(h9.4.2.6)为代表的亚分支。其中以A/chicken/Guangxi/55/2005亚分支(h9.4.2.5)为主要流行分支;NA基因遗传演化分析结果表明:13株分离株位于BJ/94-like分支上,1株分离株位于G1-like分支上。内部基因遗传演化分析结果表明,所有分离株的内部基因进化分支不同。对本研究的75株分离株并结合Genbank中的代表毒株以及经典代表毒株的HA基因遗传演化分析结果表明:我国当前H9N2亚型AIV仍以BJ/94-like分支(h9.4.2)为主流分支。氨基酸序列关键位点分析结果表明:所有分离株在HA蛋白裂解位点附近均无多个连续的碱性氨基酸存在,提示所有分离株均表现为低致病性禽流感病毒的序列特征,但部分糖基化位点和受体结合位点存在突变,尤其是位于BJ/94-like分支(h9.4.2)的分离株234位点均由Q突变为L,具有结合唾液酸α2,6-半乳糖苷受体的特征,从而具有感染人的潜在风险。NA基因HB受体结合位点分析发现:位于BJ/94-like分支的分离株均发生K368N的变异;位于G1-like分支的1株分离株QA/GD/15945/15与其代表毒株相比在367、368、401、402、403位发生变异(K367N、D369E、D401N、I402N、R403W);位于BJ/94-like分支上的分离株均出现了颈部缺失的现象。对M2基因序列分析结果表明在S31N位点处除G1-like分支上的1株分离株QA/GD/15945/15和BJ/94-like的1株分离株CK/SD/16583/16不具备对金刚烷胺类药物敏感性降低的特征,其余BJ/94-like分支上的分离株均有对金刚烷胺类药物敏感性降低的特征。在PB2基因中均未出现E627K和D701N的突变。4株H9N2亚型AIV分离株对不同动物的致病性研究表明:以107EID50/200ul病毒剂量通过点眼滴鼻方式感染4周龄SPF鸡后,可以通过鸡的咽喉和泄殖腔向外排毒,呼吸道排毒量均比消化道高,在第3d是排毒高峰期;其中毒株CK/SD/17213/17的拭子排毒量最高,而且可以在鸡的多个器官中检测到较高滴度的病毒。以106EID50/50ul病毒剂量通过滴鼻方式感染4周龄SPF级BALB/c小鼠后发现BJ/94-like分支分离到的毒株均不会引起BALB/c小鼠体重明显下降,也不会引起死亡。但毒株CK/SD/17213/17能在小鼠多个脏器中进行复制,肺脏中病毒滴度最高;G1-like分支的毒株QA/GD/15945/15在感染后前3d内可引起小鼠体重小幅度下降后又呈上升趋势,但对小鼠不致死。HA-HI试验对H9N2亚型AIV的抗原性分析结果表明:BJ/94-like分支与G1-like分支的毒株的抗原存在显著性差异(0.42≤R≤0.66),位于BJ/94-like分支的不同小分支间抗原也存在不同程度的差异(0.57≤R≤1.18)。这表明我国部分地区的H9N2亚型AIV在近三年的进化过程中抗原性差异越来越明显,给该病的防控增加了困难。研究发现CK/HN/15347/15、CK/YN/16565/16、CK/SD/16757/16的抗血清对BJ/94-like分支的分离株和G1-like分支的分离株血凝抑制滴度均较高,最低可达到10log2,但其他毒株的抗血清对其血凝抑制滴度较低,因此CK/HN/15347/15、CK/YN/16565/16、CK/SD/16757/16可为疫苗候选株做更进一步研究。
【学位授予单位】:华南农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65

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