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《华南农业大学》 2005年
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番茄RNA病毒寄主因子基因ToTOM3的克隆与功能鉴定

蒙姣荣  
【摘要】: 本研究克隆了支持烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)复制的番茄基因ToTOM3。该基因全长cDNA共有1267个核苷酸,包含一个含888个核苷酸的编码区、72个核苷酸的5′非编码区和307个核苷酸的3′非编码区,编码一个含295个氨基酸、推测是一种七次跨膜蛋白的分子量为34.4 kDa的蛋白质。ToTOM3与拟南芥一个RNA病毒寄主因子基因AtTOM3有76.9%的同源性,与番茄中支持CMV的寄主因子基因ToTOM1有58.6%的同源性。 用部分基因组文库结合PCR的方法克隆了ToTOM3基因的全长转录区,共6885bp,包含11个外显子和10个内含子。11个外显子的长度依次为243、91、53、93、72、73、46、64、54、78和400bp。10个内含子的长度依次为2031、155、77、77、654、75、1274、80、333和862 bp。 相对定量RT-PCR试验表明ToTOM3基因在番茄子叶期、5叶期、10叶期、结果期等4个生育期的茎、根、叶及结果期的花和果等组织中均有表达,而且表达量基本一致,说明ToTOM3属于组成型表达基因。 将ToTOM3基因反义RNA和RNA干扰质粒通过农杆菌介导方法导入番茄,获得26株转基因番茄。Southern杂交表明,这26株转基因番茄的染色体中均携带单拷贝外源基因片段。所有的盆栽转基因番茄均能正常生长、开花和结果。 分别用TMV和CMV对5-6叶期转基因番茄和非转基因番茄苗进行接种。用TMV接种10天后,非转基因番茄苗表现出斑驳症状,而转基因苗则无任何症状表现;90天后,接种TMV的非转基因植株仍表现为斑驳症状,而转基因植株无任何症状。苋色藜枯斑定量和DAS-ELISA检测结果显示,所有的转基因植株中TMV均比非转基因对照明显减少,其中,A53中TMV的含量最低,仅相当于对照的7.0%,而A134和R(A)114所含的病毒量最高,相当于对照的52.6%。用CMV接种10天后,非转基因番茄表现出典型的花叶症状,而转基因苗则无任何症状表现;90天后,非转基因番茄苗的叶片严重黄化,形成凹突不平的疱斑,而转基因植株仅表现出轻微的斑驳症状。苋色藜枯斑定量和DAS-ELISA检测结果显示,所有的转基因植株中CMV的含量均比非转基因对照明显减少。不同的转基因株系携带的病毒量有所差异,A25所含的CMV量仅为对照的12.4%,R(A)8为对照的58.1%。高抗TMV的转基因株系同时也高抗CMV。 本研究证明,ToTOM3是TMV和CMV共同的寄主因子。同时,本研究也显示,通过抑制寄主因子的表达,可以创造出抗病毒的植物新种质。
【学位授予单位】:华南农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S436.412

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