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《华南热带农业大学》 2001年
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马铃薯块茎抗低温糖化基因工程研究

张金文  
【摘要】: 本研究从低温(1℃)贮藏1~2周的马铃薯栽培品种“甘农薯1号”块茎中提取总RNA, 利用RT-RNase和Oligo(dT)_(15)合成cDNA第一链。根据已知的AcInv酶基因碱基序列合成特 异引物,PCR扩增得到了1.92kb的特异片段克隆。将其与pGEM-T Easy Vectorl连接,转化E. coli DH5α,得到重组子pGEMA;经酶切和序列分析鉴定,该片段含有1917bp ORF,编码639 个氨基酸残基,与国外报道序列相符;用BamHⅠ和SacⅠ从pGEMA上切下目的片段,用同样的 双酶切切除pBI121上的GUS基因,然后将目的片段反向插入到pBI121的BamHⅠ和SacⅠ酶 切位点之间,构建出了AcInv酶基因反义植物表达载体pBIRA;采用DNA直接导入法已将反义 植物表达载体质粒pBIRA导入农杆菌LBA4404得到了工程菌。 在遗传转化过程中,先对受体再生系统建立进行了研究。选用试管苗茎段、叶片、试管薯 (microtuber)薄片、微型薯(minituber)薄片和大田薯块(tuber)薄片等五种外植体材料, 以MS为培养基基本成分,对生长激素的浓度和配比进行优化组合,筛选出有利于受体材料高 效再生的培养基配方。最终确定出的有利于茎段愈伤诱导的培养基为:1/2MS+0.2mg/L NAA+1.125mg/L 6-BA,两种激素摩尔浓度比为1∶5;有利于根分化的培养基为:1/2MS+0.4 mg/L NAA;有利于芽分化的培养基为:1/2MS+3.4mg/L 6-BA+4.5mg/L GA_3,两种激素摩 尔浓度比为1∶1.2。对于叶盘培养来讲,有利于愈伤诱导的培养基中NAA和6-BA绝对加入量和 摩尔浓度比均高于茎段愈伤诱导;其根分化培养基成分与茎段愈伤根分化培养基相同。在1/2 MS+4mg/L IAA+4mg/L Zea+4mg/L KT+0.5mg/L叶酸+0.05mg/L生物素+1.0mg/L 2,4- D+0.1%水解酪蛋白+3%蔗糖的培养基对薯片培养和愈伤诱导效果良好。 通过Kan敏感性试验,确定了马铃薯试管苗茎段、叶盘和各种薯片筛选的Kan使用浓度。 一般使用75mg/L Kan的选择压即可有效的防止试管苗茎段和各种薯片假转化体的出现;而试 管苗叶盘的Kan选择压较低,以25mg/L较为适宜。在转化苗生根诱导培养中,使用50mg/L Kan进行选择比较适合。 针对马铃薯受体材料特别是薯片转化培养过程中易发生褐化的问题,对如何防止褐化的技 术进行了研究。褐化速度和程度与取材发育程度有关,取自大田薯块的薯片最易褐化,微型薯 薯片、试管薯薯片和试管苗叶盘次之,茎段最轻。在光照培养条件下,薯片既使在培养基中加 入2%的PVP也无济于事。受体材料一旦褐化,基本上丧失再生能力。经过反复摸索发现,在 受体材料初期培养阶段(接种后7~9天内,包括了预培养、共培养和选择培养初期阶段)置 于暗处能有效的防止褐化,如果加入2%PVP或水解酪蛋白则效果更好。 通过预培养时间、农杆菌浓度、浸染时间、共培养时间和诱导剂等对转化的影响研究,建 立和优化了转化体系。总体来讲,茎段预培养2天,叶盘和薯片预培养3天转化效率最高,抗 性愈伤诱导率达到48%、43.6%和35.2%。农杆菌浓度在0.D._(600)为0.2和0.5时,外植体均能 正常形成愈伤组织,但以0.D._(600)为0.5的浓度比较适宜。从浸染时间对转化的影响来看,茎段 侵染10min,叶盘5min效果较好。由于薯片创伤面较大,粘着的菌量也较多,所以要严格控 制浸染时间,以浸染3min为好,千万不可延长时间,否则会因带菌量过多而危害加重,发 生极度褐化,致使转化失败。共培养时间以茎段2天、叶盘3天、薯片1天效果最好。诱导剂 乙酰丁酰酮(AS)对农杆菌浸染马铃薯各类受体材料有明显的促进作用;在使用AS的同时, 配合使用1μmol/L的脯氨酸(Pro)效果更好。因AS价格较贵,而转化苗的获得效率很低, 需要做大量的转化培养,AS的耗量较大。所以,对AS的使用方法进行了改进,方法是将AS涂 布到共培养的培养基表面。这一改进要比直接将AS加入培养基中更好,可节省90%的AS用量。 我们对硝酸银在转化受体出愈和芽分化中的作用进行了研究,结果硝酸银对叶盘产生任 何促进作用,相反加剧了褐化程度;但可提高转化薯片的愈伤诱导,在含10mg/L AgNO_3的培 养基上,转化薯片也可直接分化出芽。 从不同受体材料的转化效果来看,试管苗茎段是遗传转化的较好材料,具有愈伤诱导率 高,分化再生能力强,褐化程度轻,取材方便的突出优点;其次是薯片;而试管苗叶盘转化效 果最差。对国内外七个加工型品种进行了转化研究,结果显示农杆茵对马铃薯基因型存在依赖 性,“大西洋(AtaboC)”、“夏伯蒂(shapedy)”“布尔班克(Russet Burbank)”和“甘 农薯二号”等四个品种分化再生能力较强,其中大西洋、布尔班克的转化效率较高,分别达到 4%和3.l%,目前已从这四个品种上获得转化苗共23株。经PCR检测,大部分转化植株扩增产 生了1.92kb的目的片段,初步表明外源反义Aclnv基因己导入受体基因组中。将PCR检测分 析为阳性的植株进行Southern杂交,结果显示外源反义Aclnv基因已确实导入受体基因组 中。目前这些转化植株均已生根,并移栽成活。
【学位授予单位】:华南热带农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:S532

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