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《华南热带农业大学》 2001年
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巴西橡胶树43KD橡胶粒子膜蛋白cDNA的克隆及表达

彭世清  
【摘要】: 天然橡胶分子是在橡胶粒子的表面合成的,一些与天然橡胶分子合成相关的酶就位 于橡胶粒子上。除橡胶延长因子、橡胶转移酶、23KD的小粒子蛋白等少数几种橡胶粒 子膜蛋白的功能基本清楚以外,其余橡胶粒子膜蛋白的研究尚未见报道。另外,橡胶粒 子是怎样形成的,至今为止仍然是一个谜。要了解橡胶粒子的生物学功能和形成机制, 有必要了解橡胶粒子膜蛋白的结构和功能。我们对大小橡胶粒子膜蛋白进行分离、纯化, 并对其进行了SDS-PAGE图谱比较,发现橡胶树的大小橡胶粒子的某些膜蛋白的含量 存在较显著的差异,43KD的橡胶粒子膜蛋白是其中的一个差异蛋白。为了探讨43KD 的橡胶粒子膜蛋白的生物学功能,我们对其进行了cDNA的克隆和表达的研究。 本研究对43KD的橡胶粒子膜蛋白进行了分离纯化,并对N端氨基酸进行了序列分 析,N端前20个氨基酸序列为MQIFVKTLGKTITILEVESS。根据43KD的橡胶粒子膜 蛋白N端氨基酸序列,设计一简并引物,通过3'RACE的方法,获得了43KD的橡胶 粒子膜蛋白的cDNA。该cDNA含有1385个核苷酸,含有完整的阅读框架,编码381 个氨基酸。在终止密码子下游,包含有一个239bp的3'非编码区,其中包括一个多聚 腺苷酸化信号AATAAA,以及一个含17个腺苷酸的ploy(A)。将cDNA序列进行BLAST 分析,结果表明,该cDNA由5个首尾相连的的重复单元组成,每个单元编码76个氨 基酸组成的Ubiquitin单体。在最后一个单元的末端含有额外的苯丙氨酸的密码子。在 氨基酸组成上,与典型的Ubiquitin比较,第二单元的第十个氨基酸发生变异,由E→G, 第三单元的51-52,54-58位的氨基酸由KQ→SS,EDGRT→RMVAP。用Ubiquitin的抗 体对橡胶粒子膜蛋白进行Western blot分析,得到一条约43kD的杂交带,表明43KD 的橡胶粒子膜蛋白可能是一种Polyubiquitin。基因组DNA Southern杂交分析表明,编码 43kD橡胶粒子蛋白的多聚遍在蛋白基因是多拷贝基因,和从拟南芥、水稻等中获得的 ubiquitin基因报导相一致。利用Genome Walker的方法获得橡胶树Polyubiquitin基因的 5'非编码区,序列分析表明,在第一个ubiquitin的起始密码子前含有一个内含子,内 中国抓带农业科学@华审热带驭业人学 200届淬士论文 三 含厂为1门讣p。对前导序列的分析表明存在n:ArITA加x、**AT。。。川、刁加X、1-ISE以 及“*CA巾e”等凋控元件。另外,还存公一个约刀0加的小丁含线丰富(”%)的p 域。N口r山ernH。;分析表明,该基因在胶乳中的表达量比叫片和树皮中高。d:对人厂判 利升判橡胶树中,乙烯和茉莉酸处理均导致该基因表达的增强。
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