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《华南热带农业大学》 2002年
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橡胶树乳管特异表达基因hevein、ref启动子研究

邓晓东  
【摘要】: 橡胶树作为植物生物反应器理想场所,其乳管系统中表达外源蛋白具有易收获,易分离纯化等诸多优点。而要达到这一目的,则必须分离乳管特异表达的启动子。本研究首先克隆680bp的hevein基因cDNA片段。测序结果表明该680bp片段含一个开放阅读框架,编码204个氨基酸,其中N端17个氨基酸为信号肽,中间43个氨基酸为Hevein成熟肽,C端144氨基酸为未知功能多肽。然后克隆了526bp的ref cDNA片段。其中编码区414bp,编码138个氨基酸,3’端非编码区112bp。 在分离hevein基因,ref基因的基础上,通过基因步移法分离了hevein基因5’端1306bp序列(Gene Bank登录号:AF327518)。以promoter prediction软件进行基础启动子的分析,发现在865~909,1147~1189处存在可能的基础启动子区域。对该序列以Plant core软件进行顺式作用元件分析,发现Atl-motif,HSE,I-box,ABRE,ERE,EIRE等元件。同样,通过基因步移法分离ref基因5’端763bp序列(Gene Bank登录号:AF380139)。其中,启动子区域的序列长378bp,409~706为内含子序列。通过promoterprediction软件进行基础启动子的分析,结果表明在219~268处存在可能的基础启动子区域。对该序列以Plant core软件进行顺式作用元件分析,发现Atl-motif,HSE,I-box,WUN-motif,P-box,G-box等元件。 同样,通过基因步移法分离hmgl基因5’端317bp序列。其中,启动子区域的序列长258bp。通过promoter prediction软件进行基础启动子的分析,结果表明在155~205处存在可能的基础启动子区域。对该序列以Plant core软件进行顺式作用元件分析,发现CGTAC-motif,HSE,I-box,G-box等元件。 随后,通过PCR的方法对hevein基因5’端1306bp的序列进行系列缺失,并通过取代pBI121上35S启动子序列,构建了含GUS基因的嵌合植物表达载体:pBIH1(1241bp),pBIH2(805bp),pBIH3(348bp),pBIH4(224bp)。ref基因启动子也通过类似的方法,构建了含GUS基因的嵌合植物表达载体:pBIR1(378bp)。 这些嵌合植物表达载体,pBI121,以及不加载体的阴性对照3day后在胶乳中体外瞬时表达检测结果表明:pBIH1(1~1241),pBIH2(436~1241)兰色较明显,说明1241bp和805bp的hevein基因启动子片段在胶乳中具有较强的启动能力。pBIH3(893~1241),pBIH4(1016~1241),pBIR1,pBI121以及阴性对照无兰色显现。 ABA具有诱导嵌合植物表达载体表达的作用。附加0.1%ABA的样品1day后的观 2 邓晓东橡胶树乳管特异表达基因heve主n、ref启动子研究 察结果显示。pBIHI,pBIHZ,pBIH3,pBIRI有较明显的 GUS活性。而 pBllZI,pBIH4 以及阴性对照无明显的GUS活性。 pBIHZ通过基因枪转化橡胶树叶片瞬时表达检测结果表明:pBIHZ包被的微弹轰击 的叶片,沿着叶脉清晰地被染成兰色,侧脉也有微弱的兰色。PBllZI包被的微弹轰击 的叶片,在叶脉处无兰色显现,在薄壁细胞处有分散的兰色斑点。对照叶片无兰色显现。 此结果说明hevein启动子的乳管表达特异性。 在pBMZ通过农杆菌转化烟草的研究中,共得到Kan抗性苗28株。对25株Kan 抗性茵进行了 PCR检测,检测结果表明:转 pBIHZ的烟草植株,在约 800 hp的位且有 目的片段扩增出来。共有15株PCR检测呈阳性。将PCR检测呈阳性的15株植株进行 GUS的组织化学分析,结果显示:pBIHZ转化的烟草植株,在叶肉,叶脉和根中均未检 测到GUS的活性。这一结果说明pBIHZ在薄壁细胞,韧皮部,维管束的组织中不表达, 从侧面验证了pBIHZ的乳管表达特性。
【学位授予单位】:华南热带农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:S794.1

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