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《华南热带农业大学》 2003年
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抗冷冻蛋白基因(THP)遗传转化草菇的研究

郭丽琼  
【摘要】: 草菇是一种高温型的食用菌,在常规低温(4℃)条件下,其菌丝会发生自溶而死亡,子实体会发软、液化和腐烂。草菇的这一特性严重地限制了草菇的生产、新鲜草菇的流通、低温冷冻保鲜和出口创汇以及草菇菌种的低温贮藏。而且,草菇为同宗结合真菌,菌丝没有锁状联合,杂种选择缺乏标记,这给草菇的杂交育种带来极大的困难。基因工程技术的发展,报告基因转化丝状真菌的成功,抗冷冻蛋白基因克隆和转化的成功,为解决草菇抗低温这一难题提供了可能性。 抗冷冻蛋白(antifreeze proteins,AFPs)是一类具有降低生物体液冰点和抑制冰晶生长的生物活性蛋白,在低温生物的生存中起着重要的作用。目前,已从鱼类、昆虫、植物、真菌中分离了许多抗冷冻蛋白基因,而应用较多的是鱼类抗冷冻蛋白基因,它已广泛用于转化鱼类、植物等并得到了表达。然而某些昆虫抗冻蛋白具有很高的生物活性,如从云杉卷叶蛾中克隆的抗冷冻蛋白,其活性是目前所有已知北极鱼抗冷冻蛋白活性的10-30倍,甚至100倍,因而昆虫的抗冷冻蛋白基因(THP)日益受到重视。 本研究以AFP1和AFP2为引物,采用RT-PCR技术从Budworm(一种磷翅目昆虫的幼虫)的mRNA中分离得到THP基因,THP基因克隆进T-Vector载体形成质粒载体pGTHP4。同时做了以下研究: (1) 草菇对抗性标记试剂的敏感性测验:选择卡那霉素、潮霉素、遗传霉素(G418)、膦丝菌素(PPT)4种抗性标记试剂对两个同属不同种的草菇V1308(VB)和VQ进行敏感性测验。结果V1308和VQ均能在含有卡那霉素、G418、PPT的PDSA平板上生长,而在含潮霉素的PDSA上生长受抑制或完全不能生长,说明草菇只对潮霉素敏感; (2) 草菇对潮霉素的最低敏感浓度测定:选择草菇V1308、V1、和V34 3个菌株对潮霉素进行敏感性测定。结果表明,不同的草菇菌株对潮霉素的敏感性不同。这3种草菇对潮霉素的最低敏感浓度为:在固体培养基上,V1308、V1、V34分别为70、50、60μg/mL;在液体培养基上,V1308、V1、V34分别为50、35、40μg/mL。 (3)草菇基因枪法转化体系的建立:以含有35S启动子、GUS报告基因、潮霉素抗性基因的质粒pCAMBIA1301为草菇表达载体,采用基因枪转化法,设定不同的轰击参数,把外源GUS基因转化进草菇V1308的菌丝中。轰击后的菌丝经过3个阶段的筛选获得了转化子。转化子数经方差分析后表明,得到最多转化子的最佳基因枪转化参数是:氦气压力为1100Psi,真空压力为26inchesHg,靶距离为 6cm,轰击次数为1次。转化子经GUS组织化学分析及Southern B!citing检测,结 果表明了外源GUS基因已整合进草菇的基因组中,而且外源GUS基因在草菇基因 组上的插入位点不同,拷贝数也不同。草菇转化子经出菇试验及子实体菌丝的GUS 组织化学检测,证明了外源GUS基因在草菇基因组中的稳定整合及可遗传性。 (4)草菇表达载体的构建:以限制性内切酶BstEll和NCOI双酶解质粒 pCAMBIA1301,回收含有355启动子、潮霉素抗性基因的大片段。以限制性内切酶 BstZ和 NCOI双酶解质粒 pGTHP4,回收含有 THP目的基因的小片段。把回收的 THP基因片段与pCAMBIA1301的大片段通过粘端连接后,再加入接头进行环化连 接,形成了含有目的THP基因的草菇表达载体PCTH823。 (5)THP基因转化草菇V1308、VI和V34:以3mm见方的小菌块为外植体, 把质粒pCTH823包裹在金粉颗粒上,利用己建立好的草菇基因枪转化体系,把外 源THP基因转化进草菇菌株V1308、VI和V34。轰击后的菌丝经过3个阶段的潮 霉素抗性筛选后获得了1个V1308转化子、3个VI转化子和13个V34转化子。 选择 9个 V34转化子进行 PCR扩增鉴定及 Southern B!citing检测验证。结果表明, 外源THP基因己经整合进草菇的基因组上,而且外源THP基因在不同转化子基因 组上的插入位点不同,拷贝数也不相同。转化子经低温处理试验结果表明,这9个 转基因草菇对4’C低温的忍受时间比对照至少多7天。这个结果表明了外源THP 基因可在草菇的菌丝里表达。 (6)V34转化子的生物学特性观察:对 V34转化子菌丝和对照菌丝的平均生 长速度进行方差分析表明,草菇转化子之间、草菇转化子与对照之间的平均生长速 度存在极显著的差异。转化子的菌丝形态特征与对照相比产生了或多或少的变异, 这表明了由于外源基因的插入改变了草菇的基因型,从而引起草菇表型的改变。
【学位授予单位】:华南热带农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S646

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