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《华南热带农业大学》 2003年
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香蕉乙烯受体cDNA的克隆与特异性表达及RNAi技术应用于鉴定植物基因功能的方法研究

冯斗  
【摘要】: 香蕉是典型的呼吸跃变型成熟热带水果。大量研究结果证实,乙烯是跃变型成熟果实的催熟激素。跃变型成熟果实中自我催化的乙烯合成反应启始后,合成大量乙烯。乙烯被乙烯受体感知并转换成乙烯信号,乙烯信号沿其信号传导途径传递到目标功能基因后,便引发一系列与成熟相关的生理生化反应而促使果实成熟。据此,目前利用生物工程技术延缓跃变型果实成熟的策略主要有以下三种:(1)抑制果实内乙烯的生物合成;(2)降低果实对乙烯的敏感性;(3)切断乙烯信号向受控目标功能基因传递的传导途径。 生物学家已在番茄中克隆了ACC合成酶和ACC氧化酶cDNA,并证实了它们的生(?)学功能,在此基础上,利用反义RNA技术抑制ACC合成酶基因的表达,使乙烯合成大幅度减少,成功地创造出工程延熟番茄品种。 乙烯受体基因首先在拟南芥中被克隆并证实了其功能。在此基础上,从番茄中获得了五个类似拟南芥乙烯受体基因序列的cDNA克隆。其中的NR基因的生物学功能,通过反义RNA技术首先得到证实,这是果实中证实功能的首个乙烯受体基因。NR受体基因发生突变,产生对乙烯不敏感的突变体,其果实不能自然成熟。 在香蕉乙烯表达调控研究方面,本实验室已从香蕉中克隆到一个与番茄ACC合成酶基因序列同源的cDNA,目前正在利用反义RNA技术研究其生物学功能。有报道,在香蕉中已克隆到一个具有序列同源性的乙烯受体cDNA,但未见有进一步证实其功能的研究报道。 1998年Andrew Fire等首先揭示的RNA干扰(RNA interfering,RNAi)现象是一种广泛存在于生物中的、转录后水平调控基因表达的机制。研究表明,RNAi具有特异地使 2 香蕉乙烯受体cDNA克隆与特异性表达及RNAi技术应用于鉴定植物基因功能的方法研究 目标基因表达沉默的特性,因此,RNAi在短短的几年中迅速发展成为一种研究基因功能 的重要工具,成为生物领域研究的热点。 鉴定己克隆的植物CDNA的生物生物学功能,是其应用于生物工程的前提和基础。目 前,香蕉中尚未建立起完善的遗传转化再生受体系统,利用转反义基因技术鉴定基因功 能的难度较大。本文在前人的研究基础上,根据已发表的相关序列,克隆了香蕉乙烯受 体CDNA序列,并对其分布、表达进行研究,同时采用RNAi技术对报道的香蕉ACC合成 酶dNA序列和克隆的乙烯受体cDNA序列进行功能鉴定,以探索建立RNAi技术用于植物 功能基因鉴定的方法,同时为调控香蕉果实成熟的基因工程提供依据。 研究的主要结果如下: 1.设计引物,用从香蕉果实中提取的总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增得到两 条特异CDNA片段。测序结果表明,其中一个较长的CDNA序列与报道的乙烯受体CDNA序 列(gb:afll3748)的对应区段长度一致,同源率为99%。另一较短cDNA序列与该Genebank 序列的同源率为97%,但缺少该Genebank序列中的第193-1036 hp的区段。分析发现该 缺失区段的两端序列具有类似转座子序列中的短正向重复序列特征,但BLAST序列比较 结果显示该区段与报道的转座子序列没有序列同源性。 2.利用较长的克隆。DNA中约1.Ikb的区段作探针,与从四个不同香蕉品种类型 提取的基因组DNA(经EcoRI限制性内切酶酶切)进行Southern杂交,杂交结果显示, 该CDNA序列探针与四种DNA杂交后均出现一条杂交信号带:用从香蕉不同后熟发育阶段 果实(果肉)和从根、叶片(来自同一采果母株)中分别提取的总RNA作模板,使用上 述克隆乙烯受体基因。DNA序列时所设计的引物进行RT-PCR。扩增结果表明,该CDNA在 香蕉果实后熟的几个发育阶段中均有表达,而在根和叶片等组织中检测不到该。DNA的表 达。 3.构建了两种形式的dSRNA用于RNAi研究:l)siRNA用于鉴定ACC合成酶CDNA 功能,2)ShRNA用于鉴定克隆的乙烯受体CDNA的功能。通过分析报道的香蕉ACC合成酶 的CDNA序列,选择位于AUG启始密码子后约100hp处的一段高度保守的Zlbp序列,用 化学法合成相应的双链 SIRNA(Stusll iflt6Yf6Y6nC6 RNA),其 3’悬挂突出两个 U核昔 翁 酸残基的单链;设计两对引物,PCR扩增克隆的乙烯受体CDNA自sllg启始密码子起的 538 hP长区段的正向(记为 SSI)、反向(记为M)DNA序列。正反向片段连接,经测 序证实确实连接正确后,插人(替代)植物表达载体PCAMBAI2301中的GUS基因位置并 华南热带农业大学博十论文3 经双酶切证实。在所得植物表达载体PCAMBAI2301-SSI-A中,该插入mA片段处丁355 启动于之后,在宿主细胞中经转录后得到的mRNA因两端序列反向互补而形成发荚状RNA。 同时,文中针对构建含止、反向重复序列插入片段的植物表达载体过程中出现的插入片 段链内退火现象造成连接困难进行了分析,并提出解决问题的建议。 4.用基因枪法和直接注射法把该siRNA导入香蕉果实,,同时用基因枪法把上述 构建的PCAMBAI230lSSIAI导人香蕉果实,并设立以比0替代SIRNA的对照。转化果实 的乙烯释放率和呼吸强度测定结果显示,PCAM13A1230lSSIAI转化果实的呼吸强度的变 化趋势与对照的类似;双链SIRNA转化果实与对照相比,
【学位授予单位】:华南热带农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S668.1

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【引证文献】
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【同被引文献】
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