旗草内生真菌的特异PCR分析与抗菌作用的研究

【摘要】： 旗草主要分布于非洲，约100个种，其中的一些种已成为南美洲热带地区的重要牧草。这些牧草普遍被内生真菌枝顶孢属(Acremonium impliacatum)感染，二者形成互利共生的关系。本文对旗草内生真菌A．implicatum的11个分离物的遗传多样性进行了研究，多数分离物间存在遗传多样性，在PDA培养基上，一些分离物菌落突起，另一些分离物菌落凹陷。一些分离物菌落的正面为白色，而另一些分离物菌落的正面为粉红色。大多数菌落质地疏松，生长缓慢。用11个随机引物对这11个旗草内生真菌分离物基因组DNA进行RAPD分析，根据相似系数进行聚类，这些分离物被聚类为7组，组间的相似系数为0.23～0.93。用4对选择性引物对RAPD中采用的分离物进行AFLP分析，聚类结果与RAPD相符。旗草内生真菌分离物遗传多样性的存在，为从A．implicatum的自然株系中筛选有利旗草生长、但却不产生家畜毒性物质的优良菌株提供了可能，为旗草的抗性育种和高产育种提供了新的资源和方法。 通过旗草内生真菌遗传多样性研究，根据不同分离物间的相似性关系，用pGEM-T Easy Vector克隆了一个由OPAK10引导扩增出的旗草内生真菌A．implicatum所共有的RAPD产物(约500bp)，该克隆子命名为p Ai AK10-500。对该产物进行测序，基于测序结果设计引物，筛选出能特异扩增旗草内生真菌A．implicatum(扩增产物约450bp)的一对引物P1(5’TTCGAATGATAAGGCAGATC3’)和P4(5’ACGCATCCACTGTATGCTAC3’)，构建了快速检测旗草内生真菌的PCR检测法，该检测法的反应体系组成为(20 u1)：1xPCR缓冲液，3mMMgCl2，0.25mM dNTPs，0.5uM引物P1和P4，1U TaqDNA聚合酶，30ng模板DNA；：循环参数为：起始变性94℃3min：然后在94℃30sec，65℃1min，72℃1min反应45个循环；最后在72℃延伸反应10min。利用该PCR检测法探明了旗草内生真菌A．implicatum是通过种子传递的，其在植物体内可分布于根、茎、叶鞘、叶片、以及种子。并用PCR法评价了不同杀真菌剂对旗草内生真菌A．implicatum的除菌效果，杀真菌剂Benomyl、Propiconazole、Folicur对感染A．implicatum的旗草小植株进行除菌处理，每种处理都有除菌作用，但都不能100%地去除内生菌。相对而言，杀真菌剂在低浓度(10～25ug/L)长时间(35天)沙培处理的效果比高浓度(75～150mg/L)短时间(5小时)的浸根处理效果好。 旗草内生真菌A．implicatum的7个株系对旗草主要病原真菌德斯霉(Drechslera sp．)和丝核菌(Rhizoctonia soloni)在离体培养条件下的生长抑制作用试验表明，多数内生真菌株系对这两个病原菌都有生长抑制作用，不同株系对同一病原菌的抑制作用不同，同一株系对不同病原菌的抑制作用也不同，EB 6780.501和EH 32a对Dre．sp．和Rhi．solani的抑制作用都最强。旗草体内抗病试验表明，内生菌感染的植株对叶枯病具有抗性，但这种抗性随着病原菌(Rhizoctonia solani)的扩展而减弱。在体外抑菌试验中，对病原菌生长抑制能力强的内生菌株系，在旗草体内也表现出较强的抗病性。