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旗草内生真菌的特异PCR分析与抗菌作用的研究

黄东益  
【摘要】: 旗草主要分布于非洲,约100个种,其中的一些种已成为南美洲热带地区的重要牧草。这些牧草普遍被内生真菌枝顶孢属(Acremonium impliacatum)感染,二者形成互利共生的关系。本文对旗草内生真菌A.implicatum的11个分离物的遗传多样性进行了研究,多数分离物间存在遗传多样性,在PDA培养基上,一些分离物菌落突起,另一些分离物菌落凹陷。一些分离物菌落的正面为白色,而另一些分离物菌落的正面为粉红色。大多数菌落质地疏松,生长缓慢。用11个随机引物对这11个旗草内生真菌分离物基因组DNA进行RAPD分析,根据相似系数进行聚类,这些分离物被聚类为7组,组间的相似系数为0.23~0.93。用4对选择性引物对RAPD中采用的分离物进行AFLP分析,聚类结果与RAPD相符。旗草内生真菌分离物遗传多样性的存在,为从A.implicatum的自然株系中筛选有利旗草生长、但却不产生家畜毒性物质的优良菌株提供了可能,为旗草的抗性育种和高产育种提供了新的资源和方法。 通过旗草内生真菌遗传多样性研究,根据不同分离物间的相似性关系,用pGEM-T Easy Vector克隆了一个由OPAK10引导扩增出的旗草内生真菌A.implicatum所共有的RAPD产物(约500bp),该克隆子命名为p Ai AK10-500。对该产物进行测序,基于测序结果设计引物,筛选出能特异扩增旗草内生真菌A.implicatum(扩增产物约450bp)的一对引物P1(5’TTCGAATGATAAGGCAGATC3’)和P4(5’ACGCATCCACTGTATGCTAC3’),构建了快速检测旗草内生真菌的PCR检测法,该检测法的反应体系组成为(20 u1):1xPCR缓冲液,3mMMgCl2,0.25mM dNTPs,0.5uM引物P1和P4,1U TaqDNA聚合酶,30ng模板DNA;:循环参数为:起始变性94℃3min:然后在94℃30sec,65℃1min,72℃1min反应45个循环;最后在72℃延伸反应10min。利用该PCR检测法探明了旗草内生真菌A.implicatum是通过种子传递的,其在植物体内可分布于根、茎、叶鞘、叶片、以及种子。并用PCR法评价了不同杀真菌剂对旗草内生真菌A.implicatum的除菌效果,杀真菌剂Benomyl、Propiconazole、Folicur对感染A.implicatum的旗草小植株进行除菌处理,每种处理都有除菌作用,但都不能100%地去除内生菌。相对而言,杀真菌剂在低浓度(10~25ug/L)长时间(35天)沙培处理的效果比高浓度(75~150mg/L)短时间(5小时)的浸根处理效果好。 旗草内生真菌A.implicatum的7个株系对旗草主要病原真菌德斯霉(Drechslera sp.)和丝核菌(Rhizoctonia soloni)在离体培养条件下的生长抑制作用试验表明,多数内生真菌株系对这两个病原菌都有生长抑制作用,不同株系对同一病原菌的抑制作用不同,同一株系对不同病原菌的抑制作用也不同,EB 6780.501和EH 32a对Dre.sp.和Rhi.solani的抑制作用都最强。旗草体内抗病试验表明,内生菌感染的植株对叶枯病具有抗性,但这种抗性随着病原菌(Rhizoctonia solani)的扩展而减弱。在体外抑菌试验中,对病原菌生长抑制能力强的内生菌株系,在旗草体内也表现出较强的抗病性。


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