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《华南热带农业大学》 2003年
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蟋蟀神经肽基因Grb-AST_7串联体的表达及其抗血清的制备

查笑君  
【摘要】: Grb-AST_7是从蟋蟀(Gryllus bimaculatus)脑中分离的一种保幼激素抑制素,体外实验显示它强烈抑制昆虫咽侧体合成保幼激素,半衰期较其它Grb-AST长。这个多肽含有8个氨基酸残基,一级结构为N-AGMYSFGL。蟋蟀AST基因共编码15个AST多肽,Grb-AST_7是编码第7个多肽的序列,所以定名为Grb-AST_7。本文主要工作就是构建Grb-AST_7串联体,将构建后的串联体导入大肠杆菌进行表达分析。并根据它的氨基酸序列合成小肽,与载体偶联后免疫家兔诱导产生特异性抗血清。 根据Grb-AST_7和GKR(AST神经肽之间的连接序列)的编码序列设计合成两个引物。利用改进的“自身模板引物”法进行串联体的构建。先用T4 DNA polymerase构建成模板,再通过高保真DNA聚合酶(PyrobestTM DNA polymerase)PCR进行扩增,从中得到一个含有17个拷贝的Grb-AST_7的串联体。 将Grb-AST_7串联体基因克隆进大肠杆菌pET22b表达载体,将重组子导入表达宿主菌BL21(DE3)pLysS进行表达。用菌液最佳浓度(OD_(600)=0.8)和诱导剂最佳浓度(1.OmM)组合进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE可见重组质粒受体菌的空白质粒受体菌多表达了一种蛋白,且这个蛋白质的分子量与理论推导值相符合,表达含量为11.80%。 根据AST_7氨基酸序列合成小肽,用EDC做偶联剂把合成的半抗原小肽与载体BSA偶联成完全抗原,免疫家兔三次后,采血收集抗血清,用ELISA测定效价为1/400。
【学位授予单位】:华南热带农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:Q789

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【参考文献】
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